| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第9-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-38页 |
| 1.1 链霉菌简介 | 第15-17页 |
| 1.2 链霉菌FR-008简介 | 第17-19页 |
| 1.3 链霉菌宿主构建的常见策略 | 第19-24页 |
| 1.3.1 简化链霉菌基因组 | 第19页 |
| 1.3.2 优化链霉菌的生长 | 第19-23页 |
| 1.3.3 提高宿主对外源DNA的整合和生物合成基因簇的表达 | 第23页 |
| 1.3.4 遗传改造链霉菌各类调控因子 | 第23-24页 |
| 1.4 天然代谢产物生物合成基因簇的研究进展 | 第24-33页 |
| 1.4.1 杀念菌素/FR-008 | 第24-27页 |
| 1.4.2 米多霉素 | 第27-31页 |
| 1.4.3 链丝菌素 | 第31-33页 |
| 1.5 异源表达的研究进展 | 第33-38页 |
| 1.5.1 常用的链霉菌异源表达宿主 | 第33-35页 |
| 1.5.2 异源表达在抗生素研究中应用 | 第35-38页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第38-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第38-45页 |
| 2.1.1 菌株 | 第38-39页 |
| 2.1.2 质粒 | 第39-40页 |
| 2.1.3 培养基和试剂 | 第40-43页 |
| 2.1.4 本论文所用的PCR引物 | 第43-45页 |
| 2.2 实验方法 | 第45-55页 |
| 2.2.1 菌种的培养和保藏 | 第45页 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取(碱裂解法) | 第45页 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取与检验(快检) | 第45页 |
| 2.2.4 链霉菌总DNA的少量快速提取 | 第45-46页 |
| 2.2.5 DNA片段的酶切、回收及连接 | 第46-47页 |
| 2.2.6 大肠杆菌钙转感受态细胞的制备 | 第47页 |
| 2.2.7 大肠杆菌电转感受态细胞的制备 | 第47页 |
| 2.2.8 钙转 | 第47页 |
| 2.2.9 电转 | 第47-48页 |
| 2.2.10 双亲本接合转移 | 第48页 |
| 2.2.11 三亲本接合转移 | 第48-49页 |
| 2.2.12 亚硝基胍诱变链霉菌FR-008 孢子悬浮液 | 第49页 |
| 2.2.13 筛选经亚硝基胍诱变线性质粒消除突变 | 第49-50页 |
| 2.2.14 脉冲场凝胶电泳 | 第50页 |
| 2.2.15 生物信息学分析 | 第50-51页 |
| 2.2.16 生物量测定 | 第51页 |
| 2.2.17 杀念菌素/米多霉素生物活性检测 | 第51页 |
| 2.2.18 链丝菌素生物活性测定 | 第51-52页 |
| 2.2.19 杀念菌素的发酵及发酵产物的检测 | 第52页 |
| 2.2.20 米多霉素的发酵及发酵产物的检测 | 第52-53页 |
| 2.2.21 利用CRISPR/Cas9-codA(sm)系统敲除链霉菌FR-008 的大线性质粒 | 第53-55页 |
| 第三章 亚硝基胍消除链霉菌FR-008的线性质粒 | 第55-66页 |
| 3.1 亚硝基胍诱变处理链霉菌FR-008 孢子悬浮液的结果 | 第55-56页 |
| 3.2 砷抗性筛选的结果 | 第56-57页 |
| 3.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测的结果 | 第57-59页 |
| 3.4 生物活性测定定性比较突变株产杀念菌素的能力 | 第59-60页 |
| 3.5 HPLC定量检测突变株杀念菌素的产量 | 第60-61页 |
| 3.6 CRISPR/Cas9-CodA(sm)敲除链霉菌FR-008 的大线性质粒 | 第61-66页 |
| 第四章 敲除控制链霉菌FR-008 菌丝体聚集的基因 | 第66-82页 |
| 4.1 序列比对寻找控制链霉菌FR-008 菌丝体聚集的基因 | 第66-67页 |
| 4.2 多功能质粒pXYS5 的构建 | 第67-71页 |
| 4.3 遗传改造菌株的筛选 | 第71-73页 |
| 4.4 敲除控制链霉菌FR-008 菌丝体聚集的基因后的变化 | 第73-76页 |
| 4.4.1 形态变化 | 第73-74页 |
| 4.4.2 生物量变化 | 第74-75页 |
| 4.4.3 杀念菌素产量的变化 | 第75-76页 |
| 4.5 关于菌丝体分散突变株的尝试实验 | 第76-77页 |
| 4.6 验证整合到染色体上的T7 polymerase基因是否发挥功能 | 第77-79页 |
| 4.7 验证整合到染色体上的att B的特异性整合位点的功能 | 第79-82页 |
| 第五章 抗生素生物合成基因簇在菌株115#1中的异源表达 | 第82-92页 |
| 5.1 米多霉素生物合成基因簇在菌株115#1中的异源表达 | 第82-88页 |
| 5.1.1 PCR验证14A6(米多霉素生物合成基因簇)进入菌株115 | 第82-83页 |
| 5.1.2 米多霉素生物合成基因簇在菌株115#1中的异源表达 | 第83-87页 |
| 5.1.3 比较米多霉素生物合成基因簇在宿主115#1和S.lividans 1326中的异同 | 第87-88页 |
| 5.2 链丝菌素生物合成基因簇在菌株115#1中的异源表达 | 第88-92页 |
| 5.2.1 PCR验证8E6(链丝菌素生物合成基因簇)进入菌株115 | 第88-89页 |
| 5.2.2 链丝菌素生物合成基因簇在菌株115#1中的异源表达 | 第89-90页 |
| 5.2.3 比较链丝菌素生物合成基因簇在宿主115#1和1154中的异同 | 第90-92页 |
| 第六章 总结与展望 | 第92-95页 |
| 6.1 本研究的主要创新点 | 第92-93页 |
| 6.2 进一步工作的展望 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-102页 |
| 致谢 | 第102-104页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第104-106页 |
