| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 本研究所用仪器设备及试剂 | 第7-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1.1 亲环蛋白介绍 | 第13页 |
| 1.2 亲环蛋白的分类 | 第13-15页 |
| 1.3 亲环蛋白相关亚型的研究 | 第15-22页 |
| 1.3.1 CypA的相关研究 | 第15-17页 |
| 1.3.2 CyPB的相关研究 | 第17-20页 |
| 1.3.3 CyPD的相关研究 | 第20-22页 |
| 1.4 本研究的内容、目的和意义 | 第22-23页 |
| 第2章 池蝶蚌CyPC、D、H的分子特征分析 | 第23-48页 |
| 2.1 实验材料和方法 | 第24-31页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第24页 |
| 2.1.2 RNA提取 | 第24页 |
| 2.1.3 RNA的质量检测 | 第24-25页 |
| 2.1.4 SMART cDNA的合成 | 第25-26页 |
| 2.1.5 CyPC/CyPD/CyPH部分片段的获取 | 第26页 |
| 2.1.6 RACE PCR的方法克隆基因全长 | 第26-28页 |
| 2.1.7 PCR产物检测、目的片段的回收、挑克隆与测序 | 第28-30页 |
| 2.1.8 CyPC/CyPD/CyPH全长序列及开放阅读框拼接和分析 | 第30-31页 |
| 2.2 生物信息学分析 | 第31-33页 |
| 2.2.1 开放阅读框和信号肽位点分析 | 第31页 |
| 2.2.2 蛋白一级结构序列的基本分析 | 第31页 |
| 2.2.3 蛋白二级结构和同源建模 | 第31页 |
| 2.2.4 蛋白三级结构预测 | 第31-32页 |
| 2.2.5 同源性分析与系统发育分析 | 第32-33页 |
| 2.3 实验结果 | 第33-46页 |
| 2.3.1 RNA检测 | 第33页 |
| 2.3.2 池蝶蚌CyP C、D、H基因cDNA全长核酸序列分析 | 第33-39页 |
| 2.3.3 池蝶蚌CyP C、D、H蛋白结构分析 | 第39-44页 |
| 2.3.3.1 一级结构预测与分析 | 第39-40页 |
| 2.3.3.2 二级结构预测及分析 | 第40-43页 |
| 2.3.3.3 三级结构预测及分析 | 第43-44页 |
| 2.3.4 池蝶蚌CyP C、D、H与其他物种CyPC、D、H的同源性 | 第44页 |
| 2.3.5 系统发育分析 | 第44-46页 |
| 2.4 讨论 | 第46-48页 |
| 第3章 池蝶蚌CyPA、B组织表达分析 | 第48-67页 |
| 3.1 实验材料和方法 | 第48-57页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第48页 |
| 3.1.2 池蝶蚌cDNA合成 | 第48-50页 |
| 3.1.2.1 RNA的提取 | 第48-49页 |
| 3.1.2.2 RNA质量的检测 | 第49页 |
| 3.1.2.3 RNA的DNaseI处理 | 第49页 |
| 3.1.2.4 cDNA的合成 | 第49-50页 |
| 3.1.3 池蝶蚌不同组织CyPA、B基因的表达 | 第50-51页 |
| 3.1.3.1 荧光定量PCR引物设计 | 第50页 |
| 3.1.3.2 池蝶蚌CyPA、CyPB荧光定量PCR检测 | 第50-51页 |
| 3.1.4 目的片段cDNA的克隆 | 第51-52页 |
| 3.1.4.1 目的表达片段的引物设计 | 第51页 |
| 3.1.4.2 PCR体系以及所需反应的条件 | 第51-52页 |
| 3.1.4.3 PCR扩增产物的检测和PCR产物切胶回收纯化 | 第52页 |
| 3.1.5 池蝶蚌pET-32a-CyPB重组质粒的构建与鉴定 | 第52-54页 |
| 3.1.5.1 目的片段与表达载体的链接 | 第52-53页 |
| 3.1.5.2 重组质粒的转化 | 第53页 |
| 3.1.5.3 阳性重组质粒的筛选 | 第53-54页 |
| 3.1.5.4 重组质粒的酶切鉴定 | 第54页 |
| 3.1.6 重组蛋白的原核表达 | 第54页 |
| 3.1.7 多克隆抗体的制备 | 第54-55页 |
| 3.1.8 ELISA间接法测定多克隆抗体效价 | 第55页 |
| 3.1.9 Western blot检测抗体特异性 | 第55页 |
| 3.1.9.1 组织总蛋白的提取 | 第55页 |
| 3.1.9.2 Western blot | 第55页 |
| 3.1.10 CyPB在肝脏组织中的定位 | 第55-57页 |
| 3.2 实验结果 | 第57-65页 |
| 3.2.1 池蝶蚌不同组织中CyPA、B基因表达 | 第57页 |
| 3.2.2 目的表达片段PCR扩增 | 第57-58页 |
| 3.2.3 PCR产物回收 | 第58页 |
| 3.2.4 重组质粒双酶切和鉴定 | 第58页 |
| 3.2.5 目的蛋白的诱导表达 | 第58-59页 |
| 3.2.6 融合蛋白可溶性分析 | 第59-60页 |
| 3.2.7 蛋白纯化 | 第60-61页 |
| 3.2.8 Bradford法测定蛋白浓度 | 第61-62页 |
| 3.2.9 多隆抗体效价 | 第62页 |
| 3.2.10亲环蛋白B抗体特异性分析 | 第62-63页 |
| 3.2.11亲环蛋白B在肝脏组织中的定位 | 第63-65页 |
| 3.3 讨论 | 第65-67页 |
| 第4章 CyPA、B对人肝癌细胞（HePG2）生长的影响 | 第67-78页 |
| 4.1 实验材料和方法 | 第67-73页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第67页 |
| 4.1.2 池蝶蚌亲环蛋白A和亲环蛋白B目的片段cDNA的克隆 | 第67-69页 |
| 4.1.2.1 目的表达片段的引物设计 | 第67-68页 |
| 4.1.2.2 PCR体系以及所需反应的条件 | 第68页 |
| 4.1.2.3 PCR扩增产物的检测和PCR产物切胶回收纯化 | 第68-69页 |
| 4.1.3 池蝶蚌亲环蛋白A和亲环蛋白B真核表达载体的构建 | 第69页 |
| 4.1.3.1 目的片段与表达载体的链接 | 第69页 |
| 4.1.3.2 重组质粒的转化 | 第69页 |
| 4.1.3.3 阳性重组质粒的筛选 | 第69页 |
| 4.1.3.4 重组质粒的酶切鉴定 | 第69页 |
| 4.1.4 细胞培养 | 第69-71页 |
| 4.1.4.1 细胞复苏 | 第69-70页 |
| 4.1.4.2 细胞培养及传代 | 第70页 |
| 4.1.4.3 细胞株的保藏 | 第70-71页 |
| 4.1.5 细胞转染 | 第71-72页 |
| 4.1.6 激光共聚焦显微镜（LSCM)扫描带GFP荧光的HePG2细胞 | 第72页 |
| 4.1.7 流式细胞仪检测带GFP荧光HePG2细胞 | 第72-73页 |
| 4.2 实验结果 | 第73-76页 |
| 4.2.1 目的片段PCR扩增 | 第73页 |
| 4.2.2 阳性重组质粒筛选和鉴定 | 第73-74页 |
| 4.2.3 激光共聚焦显微镜（LSCM)检测带GFP荧光的HePG2细胞 | 第74-75页 |
| 4.2.4 流式细胞仪（FCM）检测带GFP荧光的HePG2细胞 | 第75-76页 |
| 4.3 讨论 | 第76-78页 |
| 第5章 结论与展望 | 第78-80页 |
| 5.1 结论 | 第78-79页 |
| 5.2 展望 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 攻读硕士期间的研究成果 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-89页 |
