缩略语表 | 第10-11页 |
摘要 | 第11-13页 |
Abstract | 第13-14页 |
前言 | 第15-20页 |
第一章 基于质粒的系列泛素连接酶E3过表达体系研究 | 第20-38页 |
1.1 实验材料、仪器和方法 | 第20-25页 |
1.1.1 实验材料和试剂 | 第20-25页 |
1.1.2 实验仪器 | 第25页 |
1.2 实验方法 | 第25-29页 |
1.2.1 E3基因片段扩增 | 第25-26页 |
1.2.2 目的片段回收 | 第26页 |
1.2.3 Gibson Assembly和转化及阳性克隆筛选 | 第26-28页 |
1.2.4 基于质粒过表达E3菌株生长曲线测定及显微镜下表型观察 | 第28页 |
1.2.5 基于质粒过表达E3菌株生长表型测定 | 第28页 |
1.2.6 基于质粒过表达E3菌株的验证及泛素化水平研究 | 第28-29页 |
1.3 酵母泛素连接酶E3基本信息及同源性分析 | 第29-32页 |
1.4 质粒过表达泛素连接酶E3菌株构建和生长表型分析 | 第32-35页 |
1.5 过表达菌株目的蛋白WB检测及泛素化水平评估 | 第35-37页 |
1.6 小结与讨论 | 第37-38页 |
第二章 基于质粒过表达泛素连接酶策略的特异性底物筛选 | 第38-55页 |
2.1 实验材料、仪器和方法 | 第38-39页 |
2.1.1 实验材料和试剂 | 第38页 |
2.1.2 实验仪器 | 第38-39页 |
2.2 实验方法 | 第39-43页 |
2.2.1 △hrt3菌株构建 | 第39页 |
2.2.2 SILAC标记 | 第39页 |
2.2.3 目的蛋白的纯化 | 第39-41页 |
2.2.4 纯化样品SDS-PAGE银染检测 | 第41页 |
2.2.5 质谱样品制备 | 第41-42页 |
2.2.6 肽段样品LC-MS/MS分析 | 第42页 |
2.2.7 利用Max Quant进行质谱数据解析 | 第42页 |
2.2.8 差异蛋白功能分析 | 第42-43页 |
2.3 实验结果与讨论 | 第43-54页 |
2.3.1 质粒过表达HRT3菌株耐受厌氧环境而对氧化刺激敏感 | 第43-44页 |
2.3.2 SILAC定量蛋白质组学结合质粒过表达菌株筛选HRT3底物 | 第44-50页 |
2.3.3 质粒过表达HRT3菌株中Ub基因拷贝数下调 | 第50-51页 |
2.3.4 利用MG132处理质粒过表达HRT3菌株辅助筛选HRT3底物 | 第51-54页 |
2.4 小结 | 第54-55页 |
第三章 基于基因组整合过表达泛素连接酶策略的特异性底物筛选 | 第55-66页 |
3.1 实验材料、仪器和方法 | 第55页 |
3.1.1 实验材料和试剂 | 第55页 |
3.1.2 实验仪器 | 第55页 |
3.2 实验方法 | 第55-58页 |
3.2.1 基因组过表达HRT3菌株构建 | 第55-57页 |
3.2.2 Chase实验 | 第57页 |
3.2.3 SILAC样品LC-MS/MS分析 | 第57-58页 |
3.3 实验结果与讨论 | 第58-65页 |
3.3.1 基因组过表达HRT3菌株构建及验证 | 第58-59页 |
3.3.2 基因组过表达菌株生长状况和表型检测 | 第59-60页 |
3.3.3 利用基因组过表达HRT3菌株进行底物筛选 | 第60-64页 |
3.3.4 潜在底物NCE103的初步验证 | 第64-65页 |
3.4 小结 | 第65-66页 |
第四章 过表达策略在E3底物筛选中优势的比较研究 | 第66-72页 |
4.1 实验材料、仪器和方法 | 第66页 |
4.1.1 实验材料和试剂 | 第66页 |
4.1.2 实验仪器 | 第66页 |
4.2 实验方法 | 第66页 |
4.3 实验结果与讨论 | 第66-71页 |
4.3.1 敲除菌株的构建和验证 | 第66-67页 |
4.3.2 △hrt3菌株与G-HRT3菌株泛素化蛋白质组鉴定比较 | 第67-71页 |
4.4 小结 | 第71-72页 |
第五章 结论与展望 | 第72-75页 |
参考文献 | 第75-79页 |
附录A 本实验中pUC57-000质粒图谱 | 第79-80页 |
附录B Gibson assembly引物列表 | 第80-85页 |
附录C 基于质粒泛素连接酶过表达菌株 | 第85-86页 |
附录D 基于质粒泛素连接酶过表达菌株生长曲线原始数据 | 第86-87页 |
附录E 泛素连接酶HRT3潜在修饰底物表 | 第87-89页 |
作者在学期间取得的学术成果 | 第89-90页 |
简历 | 第90-91页 |
致谢 | 第91-92页 |