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泛素连接酶特异性底物筛选策略比较研究

缩略语表第10-11页
摘要第11-13页
Abstract第13-14页
前言第15-20页
第一章 基于质粒的系列泛素连接酶E3过表达体系研究第20-38页
    1.1 实验材料、仪器和方法第20-25页
        1.1.1 实验材料和试剂第20-25页
        1.1.2 实验仪器第25页
    1.2 实验方法第25-29页
        1.2.1 E3基因片段扩增第25-26页
        1.2.2 目的片段回收第26页
        1.2.3 Gibson Assembly和转化及阳性克隆筛选第26-28页
        1.2.4 基于质粒过表达E3菌株生长曲线测定及显微镜下表型观察第28页
        1.2.5 基于质粒过表达E3菌株生长表型测定第28页
        1.2.6 基于质粒过表达E3菌株的验证及泛素化水平研究第28-29页
    1.3 酵母泛素连接酶E3基本信息及同源性分析第29-32页
    1.4 质粒过表达泛素连接酶E3菌株构建和生长表型分析第32-35页
    1.5 过表达菌株目的蛋白WB检测及泛素化水平评估第35-37页
    1.6 小结与讨论第37-38页
第二章 基于质粒过表达泛素连接酶策略的特异性底物筛选第38-55页
    2.1 实验材料、仪器和方法第38-39页
        2.1.1 实验材料和试剂第38页
        2.1.2 实验仪器第38-39页
    2.2 实验方法第39-43页
        2.2.1 △hrt3菌株构建第39页
        2.2.2 SILAC标记第39页
        2.2.3 目的蛋白的纯化第39-41页
        2.2.4 纯化样品SDS-PAGE银染检测第41页
        2.2.5 质谱样品制备第41-42页
        2.2.6 肽段样品LC-MS/MS分析第42页
        2.2.7 利用Max Quant进行质谱数据解析第42页
        2.2.8 差异蛋白功能分析第42-43页
    2.3 实验结果与讨论第43-54页
        2.3.1 质粒过表达HRT3菌株耐受厌氧环境而对氧化刺激敏感第43-44页
        2.3.2 SILAC定量蛋白质组学结合质粒过表达菌株筛选HRT3底物第44-50页
        2.3.3 质粒过表达HRT3菌株中Ub基因拷贝数下调第50-51页
        2.3.4 利用MG132处理质粒过表达HRT3菌株辅助筛选HRT3底物第51-54页
    2.4 小结第54-55页
第三章 基于基因组整合过表达泛素连接酶策略的特异性底物筛选第55-66页
    3.1 实验材料、仪器和方法第55页
        3.1.1 实验材料和试剂第55页
        3.1.2 实验仪器第55页
    3.2 实验方法第55-58页
        3.2.1 基因组过表达HRT3菌株构建第55-57页
        3.2.2 Chase实验第57页
        3.2.3 SILAC样品LC-MS/MS分析第57-58页
    3.3 实验结果与讨论第58-65页
        3.3.1 基因组过表达HRT3菌株构建及验证第58-59页
        3.3.2 基因组过表达菌株生长状况和表型检测第59-60页
        3.3.3 利用基因组过表达HRT3菌株进行底物筛选第60-64页
        3.3.4 潜在底物NCE103的初步验证第64-65页
    3.4 小结第65-66页
第四章 过表达策略在E3底物筛选中优势的比较研究第66-72页
    4.1 实验材料、仪器和方法第66页
        4.1.1 实验材料和试剂第66页
        4.1.2 实验仪器第66页
    4.2 实验方法第66页
    4.3 实验结果与讨论第66-71页
        4.3.1 敲除菌株的构建和验证第66-67页
        4.3.2 △hrt3菌株与G-HRT3菌株泛素化蛋白质组鉴定比较第67-71页
    4.4 小结第71-72页
第五章 结论与展望第72-75页
参考文献第75-79页
附录A 本实验中pUC57-000质粒图谱第79-80页
附录B Gibson assembly引物列表第80-85页
附录C 基于质粒泛素连接酶过表达菌株第85-86页
附录D 基于质粒泛素连接酶过表达菌株生长曲线原始数据第86-87页
附录E 泛素连接酶HRT3潜在修饰底物表第87-89页
作者在学期间取得的学术成果第89-90页
简历第90-91页
致谢第91-92页

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