摘要 | 第6-7页 |
abstract | 第7-8页 |
英文缩略表 | 第12-13页 |
第一章 综述 | 第13-23页 |
1.1 PEDV的流行病学 | 第13-14页 |
1.2 PEDV的分子病原学特征 | 第14-19页 |
1.3 PEDV在细胞上的培养 | 第19-20页 |
1.4 互作蛋白的研究方法和应用 | 第20-22页 |
1.5 研究的目的和意义 | 第22-23页 |
第二章 小肠绒毛上皮细胞cDNA文库的构建 | 第23-31页 |
引言 | 第23-24页 |
2.1 实验材料 | 第24页 |
2.1.1 细胞、病毒与单抗 | 第24页 |
2.1.2 主要试剂 | 第24页 |
2.2 实验方法 | 第24-26页 |
2.2.1 IECs细胞培养及接毒 | 第24页 |
2.2.2 PEDV感染的IFA鉴定 | 第24页 |
2.2.3 细胞总RNA的提取及检测 | 第24-25页 |
2.2.4 cDNA文库的构建 | 第25-26页 |
2.2.5 IECscDNA文库库容量鉴定 | 第26页 |
2.2.6 IECscDNA文库质量鉴定 | 第26页 |
2.3 实验结果 | 第26-30页 |
2.3.1 PEDV感染IECs的细胞病变观察 | 第26-27页 |
2.3.2 IECs总RNA的检测 | 第27-28页 |
2.3.3 LD-PCR扩增cDNA和纯化 | 第28页 |
2.3.4 IECscDNA文库库容量鉴定 | 第28-29页 |
2.3.5 IECscDNA文库质量鉴定 | 第29-30页 |
2.4 讨论 | 第30-31页 |
第三章 PEDVNsp12与IECs-cDNA文库互作的蛋白筛选和验证 | 第31-41页 |
引言 | 第31-32页 |
3.1 实验材料 | 第32页 |
3.1.1 质粒和菌株 | 第32页 |
3.1.2 主要试剂和仪器 | 第32页 |
3.1.3 引物设计 | 第32页 |
3.2 实验方法 | 第32-34页 |
3.2.1 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒的构建 | 第32页 |
3.2.2 Y2H酵母感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
3.2.3 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒毒性检验 | 第33页 |
3.2.4 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒自激活检验 | 第33页 |
3.2.5 酵母双杂交对照实验的建立 | 第33页 |
3.2.6 杂交筛选pGBKT7-Nsp12的互作蛋白 | 第33页 |
3.2.7 pGBKT7-Nsp12与IECs文库互作蛋白PCR鉴定 | 第33-34页 |
3.2.8 回复杂交验证pGBKT7-Nsp12与Prey的互作 | 第34页 |
3.3 实验结果 | 第34-39页 |
3.3.1 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒的构建 | 第34-35页 |
3.3.2 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒毒性检验 | 第35页 |
3.3.3 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒的自激活验证 | 第35-36页 |
3.3.4 酵母双杂交实验阴、阳性对照实验的建立 | 第36-37页 |
3.3.5 双杂交筛选互作蛋白和PCR鉴定 | 第37页 |
3.3.6 回复杂交验证pGBKT7-Nsp12与Prey的互作 | 第37-39页 |
3.4 讨论 | 第39-41页 |
第四章 PEDVNsp12蛋白与RNF7互作鉴定及生物学意义分析 | 第41-50页 |
引言 | 第41-42页 |
4.1 实验材料 | 第42-43页 |
4.1.1 毒株和细胞系 | 第42页 |
4.1.2 主要试剂和仪器 | 第42页 |
4.1.3 引物设计 | 第42-43页 |
4.2 实验方法 | 第43-44页 |
4.2.1 提取IECs的总RNA并反转录 | 第43页 |
4.2.2 构建pCAGGS-RNF7和pCAGGS-Nsp12-FLAG真核表达质粒 | 第43页 |
4.2.3 Co-IP验证Nsp12与RNF7的互相作用 | 第43-44页 |
4.2.4 激光共聚焦实验 | 第44页 |
4.2.5 PEDV感染后对Vero细胞内源性RNF7表达的影响 | 第44页 |
4.2.6 过表达RNF7检测PEDV在Vero细胞复制的影响 | 第44页 |
4.3 实验结果 | 第44-48页 |
4.3.1 构建pCAGGS-RNF7和pCAGGS-Nsp12-FLAG真核表达质粒 | 第44-46页 |
4.3.2 Co-IP验证Nsp12与RNF7的互相作用 | 第46页 |
4.3.3 Nsp12与RNF7的亚细胞定位 | 第46-47页 |
4.3.4 PEDV感染对RNF7蛋白表达的影响 | 第47页 |
4.3.5 过表达RNF7对PEDV复制的影响 | 第47-48页 |
4.4 讨论 | 第48-50页 |
第五章 全文结论 | 第50-51页 |
参考文献 | 第51-57页 |
致谢 | 第57-58页 |
作者简介 | 第58页 |