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猪流行性腹泻病毒Nsp12互作蛋白的鉴定及作用分析

摘要第6-7页
abstract第7-8页
英文缩略表第12-13页
第一章 综述第13-23页
    1.1 PEDV的流行病学第13-14页
    1.2 PEDV的分子病原学特征第14-19页
    1.3 PEDV在细胞上的培养第19-20页
    1.4 互作蛋白的研究方法和应用第20-22页
    1.5 研究的目的和意义第22-23页
第二章 小肠绒毛上皮细胞cDNA文库的构建第23-31页
    引言第23-24页
    2.1 实验材料第24页
        2.1.1 细胞、病毒与单抗第24页
        2.1.2 主要试剂第24页
    2.2 实验方法第24-26页
        2.2.1 IECs细胞培养及接毒第24页
        2.2.2 PEDV感染的IFA鉴定第24页
        2.2.3 细胞总RNA的提取及检测第24-25页
        2.2.4 cDNA文库的构建第25-26页
        2.2.5 IECscDNA文库库容量鉴定第26页
        2.2.6 IECscDNA文库质量鉴定第26页
    2.3 实验结果第26-30页
        2.3.1 PEDV感染IECs的细胞病变观察第26-27页
        2.3.2 IECs总RNA的检测第27-28页
        2.3.3 LD-PCR扩增cDNA和纯化第28页
        2.3.4 IECscDNA文库库容量鉴定第28-29页
        2.3.5 IECscDNA文库质量鉴定第29-30页
    2.4 讨论第30-31页
第三章 PEDVNsp12与IECs-cDNA文库互作的蛋白筛选和验证第31-41页
    引言第31-32页
    3.1 实验材料第32页
        3.1.1 质粒和菌株第32页
        3.1.2 主要试剂和仪器第32页
        3.1.3 引物设计第32页
    3.2 实验方法第32-34页
        3.2.1 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒的构建第32页
        3.2.2 Y2H酵母感受态细胞的制备第32-33页
        3.2.3 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒毒性检验第33页
        3.2.4 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒自激活检验第33页
        3.2.5 酵母双杂交对照实验的建立第33页
        3.2.6 杂交筛选pGBKT7-Nsp12的互作蛋白第33页
        3.2.7 pGBKT7-Nsp12与IECs文库互作蛋白PCR鉴定第33-34页
        3.2.8 回复杂交验证pGBKT7-Nsp12与Prey的互作第34页
    3.3 实验结果第34-39页
        3.3.1 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒的构建第34-35页
        3.3.2 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒毒性检验第35页
        3.3.3 pGBKT7-Nsp12诱饵质粒的自激活验证第35-36页
        3.3.4 酵母双杂交实验阴、阳性对照实验的建立第36-37页
        3.3.5 双杂交筛选互作蛋白和PCR鉴定第37页
        3.3.6 回复杂交验证pGBKT7-Nsp12与Prey的互作第37-39页
    3.4 讨论第39-41页
第四章 PEDVNsp12蛋白与RNF7互作鉴定及生物学意义分析第41-50页
    引言第41-42页
    4.1 实验材料第42-43页
        4.1.1 毒株和细胞系第42页
        4.1.2 主要试剂和仪器第42页
        4.1.3 引物设计第42-43页
    4.2 实验方法第43-44页
        4.2.1 提取IECs的总RNA并反转录第43页
        4.2.2 构建pCAGGS-RNF7和pCAGGS-Nsp12-FLAG真核表达质粒第43页
        4.2.3 Co-IP验证Nsp12与RNF7的互相作用第43-44页
        4.2.4 激光共聚焦实验第44页
        4.2.5 PEDV感染后对Vero细胞内源性RNF7表达的影响第44页
        4.2.6 过表达RNF7检测PEDV在Vero细胞复制的影响第44页
    4.3 实验结果第44-48页
        4.3.1 构建pCAGGS-RNF7和pCAGGS-Nsp12-FLAG真核表达质粒第44-46页
        4.3.2 Co-IP验证Nsp12与RNF7的互相作用第46页
        4.3.3 Nsp12与RNF7的亚细胞定位第46-47页
        4.3.4 PEDV感染对RNF7蛋白表达的影响第47页
        4.3.5 过表达RNF7对PEDV复制的影响第47-48页
    4.4 讨论第48-50页
第五章 全文结论第50-51页
参考文献第51-57页
致谢第57-58页
作者简介第58页

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