| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 综述一 布鲁氏菌OMP25研究进展 | 第9-11页 |
| 综述二 基因敲除的原理、方法与应用 | 第11-23页 |
| 1 基因敲除的原理 | 第11-12页 |
| 2 基因敲除的方法 | 第12-21页 |
| 2.1 敲除载体质粒的构建 | 第12-14页 |
| 2.1.1 基因敲除载体的选择 | 第12-13页 |
| 2.1.2 靶基因与外源标记基因的选择 | 第13-14页 |
| 2.2 置换型质粒转化受体细胞 | 第14-16页 |
| 2.2.1 电击穿孔转化法 | 第14-15页 |
| 2.2.2 Ca~(2+)处理热激转化法 | 第15页 |
| 2.2.3 PEG(聚乙二醇)介导原生质体转化法 | 第15页 |
| 2.2.4 DNA显微注射转化法 | 第15-16页 |
| 2.2.5 基因枪高速转化法 | 第16页 |
| 2.2.6 农杆菌介导转化法 | 第16页 |
| 2.3 外源基因转化细胞后筛选 | 第16-21页 |
| 2.3.1 同源重组类型 | 第17-19页 |
| 2.3.2 基因分析法 | 第19-20页 |
| 2.3.3 遗传筛选法 | 第20-21页 |
| 2.4 基因缺失后重组细胞的鉴定 | 第21页 |
| 3 基因敲除的应用 | 第21-22页 |
| 研究目的和意义 | 第22-23页 |
| 第一部分 B.melitensis M5-90-△OMP25株的构建与检测 | 第23-41页 |
| 1 实验材料 | 第23-26页 |
| 1.1 菌株 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂 | 第23-24页 |
| 1.3 仪器 | 第24页 |
| 1.4 常用试剂配制 | 第24-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-34页 |
| 2.1 B.melitensis M5-90-△OMP25株构建流程图 | 第26-27页 |
| 2.2 B.melitensis M5-90-△OMP25株的构建 | 第27-34页 |
| 2.2.1 B.melitensis M5-90株基因组获取 | 第27页 |
| 2.2.2 缺失株引物设计 | 第27页 |
| 2.2.3 目的基因扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.4 回收纯化PCR产物 | 第28-29页 |
| 2.2.5 目的基因与pMD20-T载体连接 | 第29页 |
| 2.2.6 连接产物转化 | 第29页 |
| 2.2.7 小量提取质粒DNA | 第29-30页 |
| 2.2.8 重组质粒的酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.9 同源重组自杀载体pGEM-7Zf-△OMP25的构建 | 第31页 |
| 2.2.10 M5-90感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.11 电转化M5-90感受态细胞 | 第32页 |
| 2.2.12 B.melitensis M5-90-△OMP25株的筛选 | 第32页 |
| 2.2.13 B.melitensis M5-90-△OMP25株的鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2.14 B.melitensis M5-90-△OMP25株的遗传稳定性检测 | 第33页 |
| 2.2.15 B.melitensis M5-90-△OMP25株冻存 | 第33-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-40页 |
| 3.1 OMP25左同源臂、右同源臂、Kan~r基因片段PCR的扩增结果 | 第34-35页 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 3.3 重组质粒pGEM-7Zf-AOMP25的酶切鉴定 | 第36-37页 |
| 3.4 B.melitensis M5-90-△OMP25株鉴定 | 第37-39页 |
| 3.5 B.melitensis M5-90-△OMP25株的遗传稳定性检测 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40页 |
| 5 结论 | 第40-41页 |
| 第二部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7细胞的miRNAs表达谱分析 | 第41-52页 |
| 1 实验材料 | 第41-43页 |
| 1.1 菌株及细胞 | 第41-42页 |
| 1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 1.3 仪器 | 第42-43页 |
| 1.4 常用试剂配制 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43-47页 |
| 2.1 芯片样品制备 | 第43-47页 |
| 2.1.1 RAW264.7细胞的培养 | 第43-44页 |
| 2.1.2 冻存菌液复苏 | 第44页 |
| 2.1.3 菌体收集 | 第44页 |
| 2.1.4 感染RAW264.7细胞 | 第44页 |
| 2.1.5 总RNA提取 | 第44-45页 |
| 2.1.6 总RNA变性琼脂糖凝胶鉴定 | 第45页 |
| 2.1.7 miRNA芯片实验 | 第45页 |
| 2.1.8 差异miRNA鉴定与分析 | 第45-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-50页 |
| 3.1 总RNA质检结果 | 第47-48页 |
| 3.2 差异miRNAs芯片结果 | 第48-49页 |
| 3.3 qRT-PCR鉴定差异表达miRNAs | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 第三部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7细胞的mRNAs表达谱分析 | 第52-64页 |
| 1 实验材料 | 第52-53页 |
| 1.1 菌株及细胞 | 第52页 |
| 1.2 主要试剂 | 第52-53页 |
| 1.3 仪器 | 第53页 |
| 1.4 常用试剂配制 | 第53页 |
| 2 实验方法 | 第53-55页 |
| 2.1 芯片样品制备 | 第53-55页 |
| 2.1.1 RAW264.7细胞的培养 | 第53页 |
| 2.1.2 冻存菌液复苏 | 第53页 |
| 2.1.3 菌体收集 | 第53页 |
| 2.1.4 感染RAW264.7细胞 | 第53页 |
| 2.1.5 总RNA提取 | 第53页 |
| 2.1.6 总RNA质检 | 第53页 |
| 2.1.7 样本标记和杂交 | 第53-54页 |
| 2.1.8 芯片结果分析流程 | 第54-55页 |
| 3 结果与分析 | 第55-63页 |
| 3.1 总RNA质检结果 | 第55-57页 |
| 3.2 数据标准化结果 | 第57-60页 |
| 3.3 GO富集结果 | 第60-62页 |
| 3.4 差异mRNAs结果 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63页 |
| 5 结论 | 第63-64页 |
| 第四部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7的microRNAs表达谱和mRNAs表达谱的联合分析 | 第64-75页 |
| 1 实验材料 | 第64页 |
| 1.1 材料 | 第64页 |
| 1.2 主要试剂 | 第64页 |
| 1.3 仪器 | 第64页 |
| 1.4 常用试剂配制 | 第64页 |
| 2 实验方法 | 第64-68页 |
| 2.1 miRNAs-mRNAs表达联合分析 | 第64-65页 |
| 2.2 qRT-PCR验证miRNAs-mRNAs表达联合分析预测的靶基因 | 第65-68页 |
| 2.2.1 RNA反转录 | 第65-66页 |
| 2.2.2 qRT-PCR验证 | 第66-68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-73页 |
| 3.1 miRNAs-mRNAs表达联合分析结果 | 第68-71页 |
| 3.2 qRT-PCR验证结果 | 第71-73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 5 结论 | 第74-75页 |
| 创新点 | 第75页 |
| 全文结论 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-85页 |
| 中英文缩写词对照表 | 第85-87页 |
| 附录 | 第87-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
