| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词对应表 | 第9-14页 |
| 1. 文献综述 | 第14-26页 |
| 1.1 前言 | 第14-15页 |
| 1.2 链霉菌全局及多效性调控基因研究进展 | 第15-20页 |
| 1.2.1 双组份调控系统 | 第15-17页 |
| 1.2.2 稀有密码子识别调控--bldA | 第17-19页 |
| 1.2.3 全局调控蛋白--DasR | 第19-20页 |
| 1.3 链霉菌中多效调控蛋白AdpA的研究背景 | 第20-22页 |
| 1.4 链霉菌形态分化调控机制研究进展 | 第22-24页 |
| 1.4.1 bld家族基因 | 第23-24页 |
| 1.4.2 whi家族基因 | 第24页 |
| 1.5 本课题的工作基础、目的和展望 | 第24-26页 |
| 2. AdpA_(ch)的双向调控分子机制 | 第26-66页 |
| 2.1 引言 | 第26-27页 |
| 2.2 材料 | 第27-36页 |
| 2.2.1 菌株 | 第27-28页 |
| 2.2.2 质粒载体 | 第28-29页 |
| 2.2.3 引物 | 第29-34页 |
| 2.2.4 主要仪器设备 | 第34-35页 |
| 2.2.5 培养基 | 第35页 |
| 2.2.6 常用试剂 | 第35-36页 |
| 2.3 方法 | 第36-47页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒抽提 | 第36页 |
| 2.3.2 大肠杆菌Cosmid抽提 | 第36-37页 |
| 2.3.3 核酸片段割胶回收 | 第37页 |
| 2.3.4 链霉菌基因组提取 | 第37-38页 |
| 2.3.5 PCR相关技术 | 第38-39页 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39页 |
| 2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第39-40页 |
| 2.3.8 重组蛋白诱导表达 | 第40页 |
| 2.3.9 重组蛋白纯化 | 第40-41页 |
| 2.3.10 恰塔努加链霉菌孢子收取及保存 | 第41页 |
| 2.3.11 EMSA实验流程 | 第41-42页 |
| 2.3.12 DNase I Footprinting | 第42-43页 |
| 2.3.13 DNA affinity实验流程 | 第43-44页 |
| 2.3.14 恰塔努加链霉菌RNA提取 | 第44页 |
| 2.3.15 荧光定量PCR | 第44-45页 |
| 2.3.16 XylE酶活测定 | 第45-46页 |
| 2.3.17 抑菌圈实验 | 第46页 |
| 2.3.18 恰塔努加链霉菌摇瓶发酵及抗生素测定 | 第46-47页 |
| 2.4 结果 | 第47-62页 |
| 2.4.1 DNA affinity 捕获结合在scnRⅠ-scnRⅡ的间隔区蛋白 | 第47-49页 |
| 2.4.2 蛋白表达及EMSA验证 | 第49-52页 |
| 2.4.3 AdpA_(ch)与scnRⅠ-scnRⅡ间隔区序列结合的特异性验证 | 第52-53页 |
| 2.4.4 AdpA_(ch)不调控纳他霉素合成基因 | 第53-55页 |
| 2.4.5 AdpA_(ch)对scnRⅠ和scnRⅡ的转录活性分析 | 第55-56页 |
| 2.4.6 AdpA_(ch)在scnRⅠ-scnRⅡ的间隔区结合序列分析 | 第56-58页 |
| 2.4.7 结合位点确认及点突变验证结合序列保守性 | 第58-60页 |
| 2.4.8 xylE报告基因分析各结合位点的功能 | 第60-62页 |
| 2.4.9 各结合位点对纳他霉素产量的影响 | 第62页 |
| 2.5 小结与讨论 | 第62-66页 |
| 3. AdpA_(ch)的自反馈机制研究 | 第66-80页 |
| 3.1 引言 | 第66页 |
| 3.2 材料 | 第66-69页 |
| 3.2.1 菌株 | 第66-67页 |
| 3.2.2 质粒载体 | 第67-68页 |
| 3.2.3 引物 | 第68-69页 |
| 3.2.4 主要仪器设备 | 第69页 |
| 3.2.5 培养基 | 第69页 |
| 3.3 方法 | 第69页 |
| 3.4 结果 | 第69-78页 |
| 3.4.1 adpA_(ch)缺失对自身转录影响分析 | 第69-70页 |
| 3.4.2 EMSA验证AdpA_(ch)的自调控机制 | 第70-71页 |
| 3.4.3 AdpA_(ch)在自身启动子上的结合序列分析 | 第71-72页 |
| 3.4.4 AdpA_(ch)在自身启动子上的结合序列保守性分析 | 第72-73页 |
| 3.4.5 竞争性实验分析两结合位点结合能力强弱 | 第73-74页 |
| 3.4.6 xylE报告基因分析两结合位点对启动子活性影响 | 第74-75页 |
| 3.4.7 结合位点序列突变分析对纳他霉素产量的影响 | 第75-76页 |
| 3.4.8 高产菌株构建 | 第76-78页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第78-80页 |
| 4. AdpA_(ch)与WblA_(ch)协同调控形态分化与生物合成的分子机制 | 第80-102页 |
| 4.1 引言 | 第80页 |
| 4.2 材料 | 第80-83页 |
| 4.2.1 菌株 | 第80-81页 |
| 4.2.2 质粒载体 | 第81-82页 |
| 4.2.3 引物 | 第82-83页 |
| 4.2.4 主要仪器设备 | 第83页 |
| 4.2.5 培养基 | 第83页 |
| 4.3 方法 | 第83-86页 |
| 4.3.1 PCR-targeting基因敲除关键技术 | 第84-85页 |
| 4.3.2 Souther杂交 | 第85-86页 |
| 4.4 结果 | 第86-99页 |
| 4.4.1 Microarray分析AdpA_(ch)对恰塔努加链霉菌的全局性影响 | 第86-88页 |
| 4.4.2 AdpA_(ch)对形态分化相关基因—wblA_(ch)转录水平影响 | 第88-90页 |
| 4.4.3 AdpA_(ch)对wblA_(ch)调控方式分析 | 第90-91页 |
| 4.4.4 AdpA_(ch)在wblA_(ch)启动子上结合靶序列确定 | 第91-92页 |
| 4.4.5 AdpA_(ch)在wblA_(ch)启动子上结合序列的保守性验证 | 第92页 |
| 4.4.6 wblA_(ch)敲除株的构建及验证 | 第92-94页 |
| 4.4.7 wblA_(ch)缺失对形态发育影响分析 | 第94-95页 |
| 4.4.8 wblA_(ch)影响形态分化机制研究 | 第95-96页 |
| 4.4.9 wblA_(ch)在纳他霉素合成过程中的作用 | 第96-98页 |
| 4.4.10 wblA_(ch)缺失对scnRⅠ和scnRⅡ转录水平分析 | 第98-99页 |
| 4.4.11 wblA_(ch)对自身转录影响 | 第99页 |
| 4.5 小结与讨论 | 第99-102页 |
| 5. 研究成果与展望 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-113页 |
| 附录 | 第113-116页 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 | 第116-117页 |
| 致谢 | 第117页 |
