| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-25页 |
| 1.1 钙调素（CaM） | 第18-19页 |
| 1.1.1 钙调素的结构和功能 | 第18-19页 |
| 1.1.2 钙调素在生物体中的分布以及作用机制 | 第19页 |
| 1.1.3 钙调素在寄生虫中所起的作用 | 第19页 |
| 1.2 钙网织蛋白（CRT） | 第19-21页 |
| 1.2.1 钙网织蛋白的结构和功能 | 第19-20页 |
| 1.2.2 钙网织蛋白在细胞中的分布以及作用机制 | 第20页 |
| 1.2.3 钙网织蛋白在寄生虫中所起的作用 | 第20-21页 |
| 1.3 钙依赖蛋白激酶（CDPKS） | 第21-22页 |
| 1.3.1 钙依赖蛋白激酶的结构和功能 | 第21页 |
| 1.3.2 钙依赖蛋白激酶在生物体中的分布以及作用机制 | 第21-22页 |
| 1.3.3 钙依赖蛋白激酶在寄生虫中所起的作用 | 第22页 |
| 1.4 膜联蛋白（Annexin） | 第22-23页 |
| 1.4.1 膜联蛋白的结构与功能 | 第22-23页 |
| 1.4.2 膜联蛋白在生物体中的分布以及作用机制 | 第23页 |
| 1.4.3 膜联蛋白在寄生虫中所起的作用 | 第23页 |
| 1.5 展望 | 第23-25页 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的克隆及生物信息学分析 | 第25-48页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料与方法 | 第25-39页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第25-26页 |
| 2.2.2 实验虫株 | 第26页 |
| 2.2.3 实验所需主要试剂 | 第26页 |
| 2.2.4 主要实验所需仪器 | 第26-27页 |
| 2.2.5 实验所需试剂配制方法 | 第27页 |
| 2.2.6 柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段虫体的收集与纯化 | 第27-29页 |
| 2.2.7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的抽提 | 第29-30页 |
| 2.2.8 柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA末端快速扩增法（RACE）模板的制备 | 第30-32页 |
| 2.2.9 目的基因cDNA 5’-末端和 3’-末端序列的扩增 | 第32-35页 |
| 2.2.10 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4蛋白基因的生物信息学分析 | 第35页 |
| 2.2.11 反转录合成与制备柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段cDNA模板 | 第35页 |
| 2.2.12 柔嫩艾美耳球虫目的基因EtCDPK4完整开放阅读框的PCR扩增 | 第35-36页 |
| 2.2.13 钙依赖蛋白激酶4在柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段转录水平的差异分析 | 第36-39页 |
| 2.3 结果 | 第39-46页 |
| 2.3.1 纯化和收集柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的虫体 | 第39页 |
| 2.3.2 柔嫩艾美耳球虫虫体总RNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.3.3 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4基因的克隆 | 第40-41页 |
| 2.3.4 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4基因的生物信息学预测和分析 | 第41-46页 |
| 2.3.5 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4在4个不同发育阶段的转录水平差异分析 | 第46页 |
| 2.4 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4蛋白表达及其特性的初步研究 | 第48-74页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 材料与方法 | 第48-62页 |
| 3.2.1 实验动物 | 第48页 |
| 3.2.2 实验寄生虫虫株、载体和细胞 | 第48页 |
| 3.2.3 实验所需试剂 | 第48-49页 |
| 3.2.4 实验所需主要仪器设备 | 第49页 |
| 3.2.5 主要实验所需试剂的配制方法 | 第49-51页 |
| 3.2.6 重组表达系统pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4构建与鉴定 | 第51-52页 |
| 3.2.7 重组表达质粒pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4的表达 | 第52-54页 |
| 3.2.8 原核表达系统pColdⅠ-EtCDPK4表达重组蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 3.2.9 rEtCDPK4重组蛋白多克隆抗体的制备与抗体的纯化 | 第55-56页 |
| 3.2.10 重组蛋白rEtCDPK4的免疫原性和反应原性检测分析 | 第56-58页 |
| 3.2.11 DF-1 细胞的复苏与传代培养 | 第58页 |
| 3.2.12 EtCDPK4在柔嫩艾美耳球虫入侵DF-1 不同发育阶段的分布与定位分析 | 第58-59页 |
| 3.2.13 间接免疫荧光鉴定重组真核表达质粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1中的表达情况 | 第59页 |
| 3.2.14 兔抗rEtCDPK4重组蛋白多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的体外抑制分析 | 第59-60页 |
| 3.2.15 EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫4个不同的发育阶段中蛋白质翻译水平的差异分析 | 第60-62页 |
| 3.3 结果 | 第62-72页 |
| 3.3.1 EtCDPK4原核表达重组质粒的构建 | 第62-63页 |
| 3.3.2 EtCDPK4重组蛋白的诱导表达及其蛋白纯化 | 第63-65页 |
| 3.3.3 兔抗rEtCDPK4多克隆抗体的制备 | 第65页 |
| 3.3.4 rEtCDPK4重组蛋白免疫原性和反应原性的分析 | 第65-67页 |
| 3.3.5 柔嫩艾美耳球虫虫体CDPK4天然蛋白的间接免疫荧光定位 | 第67-69页 |
| 3.3.6 间接免疫荧光鉴定真核重组表达质粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1细胞中的表达情况 | 第69-70页 |
| 3.3.7 兔抗rEtCDPK4多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1 细胞的体外抑制实验 | 第70-71页 |
| 3.3.8 柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段中EtCDPK4蛋白翻译的分析 | 第71-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-74页 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4催化活性初步研究 | 第74-86页 |
| 4.1 引言 | 第74页 |
| 4.2 材料与方法 | 第74-78页 |
| 4.2.1 实验寄生虫虫株、细胞 | 第74页 |
| 4.2.2 实验所需试剂 | 第74页 |
| 4.2.3 实验所需主要仪器设备 | 第74-75页 |
| 4.2.4 实验所需试剂的配制方法 | 第75页 |
| 4.2.5 rEtCDPK4重组蛋白酶活性的测定 | 第75-77页 |
| 4.2.6 不同Ca~(2+)浓度对rEtCDPK4酶催化活性大小的影响 | 第77页 |
| 4.2.7 rEtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显著性分析 | 第77-78页 |
| 4.2.8 筛选出的rEtCDPK4酶活性抑制剂抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的体外入侵抑制试验 | 第78页 |
| 4.3 结果 | 第78-83页 |
| 4.3.1 rEtCDPK4酶活性的测定 | 第78-79页 |
| 4.3.2 不同Ca~(2+)浓度对rEtCDPK4酶活性大小的影响 | 第79-81页 |
| 4.3.3 rEtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显著性分析 | 第81-82页 |
| 4.3.4 筛选出的rEtCDPK4酶活性特异性抑制剂抑制子孢子对DF-1 细胞入侵试验 | 第82-83页 |
| 4.4 讨论 | 第83-86页 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4相互作用底物筛选 | 第86-105页 |
| 5.1 引言 | 第86页 |
| 5.2 材料与方法 | 第86-96页 |
| 5.2.1 实验所需酵母菌株、载体和细胞 | 第86-87页 |
| 5.2.2 酵母双杂交筛选cDNA文库 | 第87页 |
| 5.2.3 实验所需主要试剂 | 第87页 |
| 5.2.4 实验所需主要仪器 | 第87页 |
| 5.2.5 实验所需试剂的配制 | 第87-90页 |
| 5.2.6 酵母诱饵Et CDPK4质粒的构建 | 第90页 |
| 5.2.7 酵母菌株Y2HGold感受态细胞的制备 | 第90-91页 |
| 5.2.8 BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4转化入酵母Y2HGold感受态细胞 | 第91-92页 |
| 5.2.9 重组酵母诱饵菌的PCR鉴定 | 第92页 |
| 5.2.10 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测 | 第92页 |
| 5.2.11 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测 | 第92-93页 |
| 5.2.12 诱饵pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold酵母宿主菌中蛋白表达情况的检测 | 第93-94页 |
| 5.2.13 使用诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4靶菌株从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库中筛选相互作用蛋白 | 第94-95页 |
| 5.2.14 使用免疫共沉淀（Co-IP）验证其中一个筛选到的阳性克隆EtSerpin | 第95-96页 |
| 5.3 结果 | 第96-102页 |
| 5.3.1 BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4的构建 | 第96-97页 |
| 5.3.2 诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4转化Y2HGold酵母菌的PCR鉴定 | 第97-98页 |
| 5.3.3 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测 | 第98页 |
| 5.3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测 | 第98-99页 |
| 5.3.5 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主酵母菌中蛋白表达情况的检测 | 第99-100页 |
| 5.3.6 酵母双杂交筛选到的阳性质粒测序分析结果和杂交效率分析 | 第100-101页 |
| 5.3.7 Co-IP验证EtCDPK4与阳性克隆EtSerpin相互作用关系 | 第101-102页 |
| 5.4 讨论 | 第102-105页 |
| 第六章 全文总结 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 作者简历 | 第115页 |
