| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 1 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 脂肪酶的概述 | 第13-14页 |
| 1.2 定向进化及其高通量方法 | 第14-16页 |
| 1.2.1 定向进化 | 第14-15页 |
| 1.2.2 高通量方法 | 第15-16页 |
| 1.2.2.1 pH指示剂法 | 第15页 |
| 1.2.2.2 用显色底物直接检测 | 第15-16页 |
| 1.2.2.3 基于紫外/可见光光谱的方法 | 第16页 |
| 1.2.2.4 基于荧光的高通量筛选 | 第16页 |
| 1.2.2.5 对于脂酶的高通量筛选方法 | 第16页 |
| 1.3 酶的固定化 | 第16-19页 |
| 1.3.1 吸附 | 第17页 |
| 1.3.2 共价结合 | 第17-18页 |
| 1.3.3 包埋 | 第18页 |
| 1.3.4 微囊化 | 第18-19页 |
| 1.3.5 固定化酶载体和固定化条件 | 第19页 |
| 1.4 甘油二酯功能和用途 | 第19-21页 |
| 1.4.1 甘油二酯的作用 | 第19-20页 |
| 1.4.2 甘油二酯的生产 | 第20-21页 |
| 1.5 课题研究内容与意义 | 第21-22页 |
| 2 脂肪酶的活性特点及其检测方法的比较 | 第22-37页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-30页 |
| 2.2.1 材料 | 第22页 |
| 2.2.2 主要实验设备 | 第22-23页 |
| 2.2.3 脂肪酶RML的纯化及其蛋白浓度的测定 | 第23-24页 |
| 2.2.3.1 RML的纯化 | 第23-24页 |
| 2.2.3.2 Bradford法测定RML的蛋白浓度 | 第24页 |
| 2.2.3.3 蛋白浓度的标准曲线 | 第24页 |
| 2.2.4 p-NPP法检测酶活 | 第24-25页 |
| 2.2.4.1 脂肪酶活力测定标准曲线的绘制 | 第24-25页 |
| 2.2.4.2 p-NPP法测定脂肪酶的活性 | 第25页 |
| 2.2.5 碱滴定法测定酶活 | 第25-27页 |
| 2.2.5.1 碱滴定法 | 第25-27页 |
| 2.2.5.2 NaOH溶液的标定 | 第27页 |
| 2.2.6 醋酸铜法测定酶活 | 第27-28页 |
| 2.2.6.1 醋酸铜法标准曲线的绘制 | 第28页 |
| 2.2.6.2 醋酸铜法测定酶活 | 第28页 |
| 2.2.7 温度、pH值、乳化剂及金属离子对RML酶活的影响 | 第28-29页 |
| 2.2.7.1 RML的最佳反应温度和pH值 | 第28页 |
| 2.2.7.2 乳化剂对RML酶活的影响 | 第28页 |
| 2.2.7.3 金属离子对RML酶活的影响 | 第28-29页 |
| 2.2.8 脂酶RML专一性的检测 | 第29-30页 |
| 2.2.8.1 液相色谱分析条件 | 第29页 |
| 2.2.8.2 甘油酯的标样 | 第29页 |
| 2.2.8.3 样品处理 | 第29-30页 |
| 2.3 结果 | 第30-36页 |
| 2.3.1 标准曲线 | 第30-31页 |
| 2.3.1.1 蛋白浓度的标准曲线 | 第30页 |
| 2.3.1.2 对硝基苯酚法标准曲线 | 第30-31页 |
| 2.3.1.3 醋酸铜法标准曲线 | 第31页 |
| 2.3.2 三种检测方法的比较 | 第31-32页 |
| 2.3.3 温度、pH值、乳化剂及金属离子对RML酶活的影响 | 第32-35页 |
| 2.3.3.1 温度、pH值对RML酶活的影响 | 第32-33页 |
| 2.3.3.2 乳化剂及金属对酶活的影响 | 第33-35页 |
| 2.3.4 RML的1,3-位专一性 | 第35-36页 |
| 2.3.4.1 标样 | 第35-36页 |
| 2.3.4.2 RML的1,3-位专一性 | 第36页 |
| 2.4 结论 | 第36-37页 |
| 3 以油脂为底物的高通量方法的建立 | 第37-48页 |
| 3.1 引言 | 第37-38页 |
| 3.2 材料与方法 | 第38-41页 |
| 3.2.1 材料 | 第38页 |
| 3.2.1.1 高通量筛选方法及其它试剂 | 第38页 |
| 3.2.1.2 菌株、质粒及其它试剂 | 第38页 |
| 3.2.2 主要实验设备 | 第38页 |
| 3.2.3 基因库的建立 | 第38-39页 |
| 3.2.4 突变体的筛选 | 第39页 |
| 3.2.5 新的高通量筛选方法 | 第39-40页 |
| 3.2.6 p-NPP高通量法 | 第40页 |
| 3.2.7 新高通量筛选方法的优化 | 第40页 |
| 3.2.8 突变体的复筛 | 第40-41页 |
| 3.2.9 酯化反应及其专一性的测定 | 第41页 |
| 3.3 结果 | 第41-47页 |
| 3.3.1 新高通量筛选方法优化结果 | 第41-42页 |
| 3.3.2 新高通量筛选方法和p-NPP的对比 | 第42-44页 |
| 3.3.3 新高通量筛选方法特点 | 第44-45页 |
| 3.3.4 酶动力学 | 第45-46页 |
| 3.3.5 新高通量筛选方法应用于定向进化的结果 | 第46页 |
| 3.3.6 各突变体酯化结果 | 第46-47页 |
| 3.4 结论 | 第47-48页 |
| 4 固定化RML的制备 | 第48-58页 |
| 4.1 引言 | 第48-49页 |
| 4.2 材料与方法 | 第49-53页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第49页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第49页 |
| 4.2.3 脂肪酶RML的制备 | 第49-50页 |
| 4.2.4 磁性酶载体的制备 | 第50-51页 |
| 4.2.4.1 制备被油酸包裹的Fe_3O_4纳米颗粒 | 第50页 |
| 4.2.4.2 Fe_3O_4与丙烯酸乙酯共聚反应 | 第50-51页 |
| 4.2.5 RML的固定化及固定化酶的重复使用率 | 第51页 |
| 4.2.6 固定化酶和游离酶的最佳反应温度和pH的比较 | 第51-52页 |
| 4.2.7 固定化酶和游离酶半衰期的测定 | 第52页 |
| 4.2.8 利用生物学软件Chimera分析RML表面的结构特点 | 第52页 |
| 4.2.9 树脂的固定化 | 第52-53页 |
| 4.2.9.1 树脂预处理 | 第52页 |
| 4.2.9.2 RML固定化过程 | 第52-53页 |
| 4.3 结果 | 第53-57页 |
| 4.3.1 磁性载体大小和磁性 | 第53-54页 |
| 4.3.1.1 粒径分布 | 第53-54页 |
| 4.3.1.2 磁性载体的磁性和分散性 | 第54页 |
| 4.3.2 磁性固定化载体制备条件 | 第54-55页 |
| 4.3.3 固定化酶的活性性能 | 第55-56页 |
| 4.3.4 RML蛋白质表面氨基残基 | 第56-57页 |
| 4.3.5 与树脂的对比 | 第57页 |
| 4.4 结论 | 第57-58页 |
| 5 酶法制备1,3-甘油二酯 | 第58-67页 |
| 5.1 引言 | 第58-60页 |
| 5.1.1 化学生产法 | 第58页 |
| 5.1.2 酶法制备1,3-甘油二酯 | 第58-59页 |
| 5.1.2.1 直接酯化法 | 第58-59页 |
| 5.1.2.2 甘油解法 | 第59页 |
| 5.1.2.3 转酯化法 | 第59页 |
| 5.1.3 甘油二酯提纯 | 第59-60页 |
| 5.2 材料与方法 | 第60-62页 |
| 5.2.1 材料 | 第60页 |
| 5.2.2 主要实验设备 | 第60页 |
| 5.2.3 标品和样品的检测方法 | 第60-61页 |
| 5.2.3.1 薄层色谱法 | 第60-61页 |
| 5.2.3.2 液相分析 | 第61页 |
| 5.2.3.3 标定1,3-油酸甘油二酯的标准曲线 | 第61页 |
| 5.2.4 直接酯化法 | 第61-62页 |
| 5.2.5 甘油解法 | 第62页 |
| 5.2.6 酰基转移 | 第62页 |
| 5.3 结果 | 第62-66页 |
| 5.3.1 甘油二酯的标准曲线及油脂出峰顺序 | 第62-63页 |
| 5.3.2 直接酯化法 | 第63-64页 |
| 5.3.3 甘油解法 | 第64-65页 |
| 5.3.4 酰基转移生成1,3-DAG | 第65-66页 |
| 5.4 结论 | 第66-67页 |
| 6 结论与展望 | 第67-69页 |
| 6.1 结论 | 第67-68页 |
| 6.2 展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-73页 |
