| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 第一章 绪论 | 第17-21页 |
| 第二章 材料 | 第21-31页 |
| 2.1 实验仪器与设备 | 第21-22页 |
| 2.2 主要试剂与配制 | 第22-31页 |
| 2.2.1 常规试剂 | 第22-24页 |
| 2.2.2 质粒与菌株 | 第24页 |
| 2.2.3 细菌培养基 | 第24页 |
| 2.2.4 蛋白电泳缓冲系统 | 第24页 |
| 2.2.5 重组蛋白分离纯化溶液 | 第24-25页 |
| 2.2.6 质粒提取溶液配制 | 第25页 |
| 2.2.7 Western blot 相关试剂的配制 | 第25-26页 |
| 2.2.8 内毒素测定相关溶液及试剂 | 第26页 |
| 2.2.9 动物实验相关材料 | 第26-27页 |
| 2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期相关试剂和材料 | 第27页 |
| 2.2.11 造血祖细胞集落培养相关试剂和溶液配制 | 第27-31页 |
| 第三章 方法 | 第31-64页 |
| 3.1 真核表达重组质粒phCMV1-mResistin 的制备 | 第31-43页 |
| 3.1.1 PCR 引物设计 | 第31-32页 |
| 3.1.2 RT-PCR 扩增mResistin 片段 | 第32-34页 |
| 3.1.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳 | 第34-35页 |
| 3.1.4 PCR 产物割胶回收 | 第35页 |
| 3.1.5 phCMV1 质粒抽提(碱裂解法) | 第35-36页 |
| 3.1.6 酶切反应 | 第36页 |
| 3.1.7 连接反应 | 第36-37页 |
| 3.1.8 感受态细胞制备(CaC12法) | 第37页 |
| 3.1.9 连接产物的转化反应 | 第37-38页 |
| 3.1.10 PCR 检测目的基因及测序 | 第38页 |
| 3.1.11 PCR 纠正突变 | 第38-40页 |
| 3.1.12 质粒大量抽提 | 第40-42页 |
| 3.1.13 抽提质粒内毒素 | 第42页 |
| 3.1.14 分光光度计测双链DNA 的浓度 | 第42-43页 |
| 3.2 mResistin 的蛋白表达、纯化与生物活性分析 | 第43-58页 |
| 3.2.1 PCR 引物设计 | 第43-44页 |
| 3.2.2 PCR 扩增mResistin 成熟肽序列 | 第44-45页 |
| 3.2.3 电泳估计浓度 | 第45页 |
| 3.2.4 mResistin 片段酶切反应 | 第45-46页 |
| 3.2.5 载体pET28a 准备 | 第46-47页 |
| 3.2.6 连接反应 | 第47页 |
| 3.2.7 连接产物的转化反应 | 第47-48页 |
| 3.2.8 双酶切检测目的基因及测序 | 第48页 |
| 3.2.9 mResistin 诱导表达条件优化 | 第48-49页 |
| 3.2.10 mResistin 的诱导表达 | 第49页 |
| 3.2.11 包涵体的分离和洗涤 | 第49-50页 |
| 3.2.12 包涵体的变性和复性 | 第50-51页 |
| 3.2.13 Sp-Sephorose 阳离子交换层析 | 第51页 |
| 3.2.14 Bradford 法测定蛋白溶液浓度 | 第51-52页 |
| 3.2.15 蛋白样品SDS-PAGE | 第52-53页 |
| 3.2.16 Western blot 检测阳离子交换柱纯化后蛋白的抗原性 | 第53-55页 |
| 3.2.17 mResistin 重组蛋白生物学活性测定 | 第55-57页 |
| 3.2.18 显色基质法测定蛋白内毒素含量 | 第57-58页 |
| 3.3 动物实验 | 第58-64页 |
| 3.3.1 小鼠骨髓细胞的获取 | 第58-59页 |
| 3.3.2 小鼠骨髓细胞总RNA 的抽提 | 第59页 |
| 3.3.3 RNA 溶液质量的检测 | 第59-60页 |
| 3.3.4 phCMV1-mRETN 质粒注射正常小鼠 | 第60页 |
| 3.3.2 外周血检测 | 第60-61页 |
| 3.3.3 骨髓细胞采集及计数 | 第61-62页 |
| 3.3.4 流式细胞仪检测骨髓单个核细胞周期 | 第62页 |
| 3.3.5 重组蛋白rmResistin 注射正常小鼠 | 第62-63页 |
| 3.3.6 高剂量5-Fu 作用下rmResistin 对小鼠存活率的影响 | 第63-64页 |
| 第四章 结果 | 第64-81页 |
| 4.1 mResistin 的基因克隆及蛋白表达纯化结果 | 第64-77页 |
| 4.1.1 总RNA 的提取结果 | 第64页 |
| 4.1.2 总RNA 的吸光度测定 | 第64-65页 |
| 4.1.3 RT-PCR 扩增mResistin CDS 序列结果 | 第65页 |
| 4.1.4 mResistin-phCMV1 PCR 鉴定及测序结果 | 第65-66页 |
| 4.1.5 PCR 纠正突变 | 第66-67页 |
| 4.1.6 mResistin-phCMV1 酶切鉴定及测序结果 | 第67-68页 |
| 4.1.7 PCR 扩增mResistin 成熟肽序列结果 | 第68-69页 |
| 4.1.8 pET28a(+)-mResistin 酶切鉴定及测序结果 | 第69-70页 |
| 4.1.9 mResistin 诱导条件的优化 | 第70页 |
| 4.1.10 mResistin 重组菌诱导表达后包涵体的准备 | 第70-71页 |
| 4.1.11 包涵体的溶解及蛋白变性复性结果 | 第71-73页 |
| 4.1.12 mResistin 过Sp-Sepharose 柱纯化结果 | 第73页 |
| 4.1.13 重组mResistin 蛋白SDS-PAGE 电泳鉴定 | 第73-74页 |
| 4.1.14 Bradford 法测定重组蛋白浓度 | 第74-75页 |
| 4.1.15 Western blot 检测蛋白抗原性 | 第75-76页 |
| 4.1.16 重组蛋白rmResistin 活性测定 | 第76页 |
| 4.1.17 重组蛋白内毒素含量测定 | 第76-77页 |
| 4.2 动物实验结果 | 第77-81页 |
| 4.2.1 重组质粒phCMV1-mResistin 注射正常小鼠结果 | 第77-78页 |
| 4.2.2 重组mResistin 蛋白注射正常小鼠结果 | 第78-79页 |
| 4.2.3 高剂量5-Fu 作用下rmResistin 对小鼠存活率的影响结果 | 第79-81页 |
| 第五章 讨论 | 第81-84页 |
| 参考文献 | 第84-87页 |
| 文献综述 | 第87-92页 |
| 参考文献 | 第92-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 硕士期间发表的论著 | 第96页 |
