| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-21页 |
| 1.1 核黄素的理化性质、功能和用途 | 第10-12页 |
| 1.1.1 核黄素的理化性质 | 第10-11页 |
| 1.1.2 核黄素的功能与用途 | 第11-12页 |
| 1.2 核黄素的工业化生产 | 第12-14页 |
| 1.2.1 核黄素生产现状 | 第12页 |
| 1.2.2 化学半合成法 | 第12页 |
| 1.2.3 微生物发酵法 | 第12-14页 |
| 1.3 B.subtilis中核黄素的生物合成途径 | 第14-17页 |
| 1.3.1 核黄素的合成途径 | 第14-16页 |
| 1.3.2 核黄素操纵子的结构 | 第16-17页 |
| 1.4 产核黄素B.subtilis工程菌的构建策略 | 第17-20页 |
| 1.4.1 诱变和基因组重排技术的运用 | 第17-18页 |
| 1.4.2 增强前体物的供应或削弱副产物的生成 | 第18-19页 |
| 1.4.3 过表达核黄素操纵子 | 第19页 |
| 1.4.4 其他的改造方法 | 第19-20页 |
| 1.5 本课题的研究内容和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第21-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-28页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第21-22页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第24-25页 |
| 2.1.5 主要培养基 | 第25页 |
| 2.1.6 PCR引物 | 第25-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-42页 |
| 2.2.1 E.coli质粒的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.2 B.subtilis基因组DNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.3 E.coli感受态细胞的转化 | 第29-30页 |
| 2.2.4 B.subtilis的spizizen转化 | 第30页 |
| 2.2.5 单片段PCR扩增目的基因 | 第30-32页 |
| 2.2.6 融合PCR | 第32-35页 |
| 2.2.6.1 一步法融合PCR | 第32-33页 |
| 2.2.6.2 两步法融合PCR | 第33-35页 |
| 2.2.7 PCR产物的纯化回收 | 第35页 |
| 2.2.8 PCR产物的胶回收 | 第35-36页 |
| 2.2.9 酶切体系 | 第36页 |
| 2.2.10 连接体系 | 第36-37页 |
| 2.2.11 琼脂糖凝胶电泳 | 第37页 |
| 2.2.12 菌种保藏 | 第37-38页 |
| 2.2.13 菌株的摇瓶发酵 | 第38页 |
| 2.2.14 发酵液中核黄素含量的测定 | 第38页 |
| 2.2.15 Marker-free基因操作方法 | 第38-42页 |
| 2.2.15.1 基于单交换同源重组的Marker-free基因操作方法 | 第38-39页 |
| 2.2.15.2 基于双交换同源重组的Marker-free基因操作方法 | 第39-41页 |
| 2.2.15.3 双交换同源重组的Marker-free基因操作方法的改进 | 第41-42页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第42-76页 |
| 3.1 B.subtilis高效重构系统的建立 | 第42-69页 |
| 3.1.1 upp作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的建立 | 第42-48页 |
| 3.1.1.1 SZ0中upp基因的敲除 | 第42-44页 |
| 3.1.1.2 重构系统的应用 | 第44-48页 |
| 3.1.2 araR作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的建立 | 第48-54页 |
| 3.1.2.1 Para-neo元件的构建 | 第48-53页 |
| 3.1.2.2 Para-neo元件的转化 | 第53-54页 |
| 3.1.3 araR作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的应用 | 第54-62页 |
| 3.1.3.1 FRX0中rbsK基因的敲除和gmk、ndk基因的过表达 | 第54-57页 |
| 3.1.3.2 FRX0中ypaA基因的敲除和ywlF基因的过表达 | 第57-59页 |
| 3.1.3.3 FRX0中xylR基因的敲除和prs基因的过表达 | 第59-62页 |
| 3.1.4 araR作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的改进 | 第62-68页 |
| 3.1.4.1 FRX0中cyd基因的敲除 | 第62-65页 |
| 3.1.4.2 FRX0中araB基因的敲除 | 第65-68页 |
| 3.1.5 各基因修饰操作在不同菌种里的叠加 | 第68-69页 |
| 3.1.5.1 FRX4中基因修饰操作的叠加 | 第68页 |
| 3.1.5.2 FRX6中基因修饰操作的叠加 | 第68页 |
| 3.1.5.3 FRX3中基因修饰操作的叠加 | 第68页 |
| 3.1.5.4 FRX10中基因修饰操作的叠加 | 第68-69页 |
| 3.1.5.5 FRX9中基因修饰操作的叠加 | 第69页 |
| 3.2 重组菌株的摇瓶发酵结果 | 第69-70页 |
| 3.3 单因素法初步优化摇瓶发酵培养基条件 | 第70-76页 |
| 3.3.1 对主要氮源的优化 | 第71页 |
| 3.3.2 对补充氮源的优化 | 第71-73页 |
| 3.3.3 TCA循环对B.subtilis核黄素产量的影响 | 第73页 |
| 3.3.4 氨基酸对核黄素合成的影响 | 第73-74页 |
| 3.3.5 核黄素前体代谢物对核黄素合成的影响 | 第74-76页 |
| 第四章 结论 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
