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枯草芽孢杆菌生产核黄素的代谢工程改造

摘要第4-5页
Abstract第5-6页
第一章 文献综述第10-21页
    1.1 核黄素的理化性质、功能和用途第10-12页
        1.1.1 核黄素的理化性质第10-11页
        1.1.2 核黄素的功能与用途第11-12页
    1.2 核黄素的工业化生产第12-14页
        1.2.1 核黄素生产现状第12页
        1.2.2 化学半合成法第12页
        1.2.3 微生物发酵法第12-14页
    1.3 B.subtilis中核黄素的生物合成途径第14-17页
        1.3.1 核黄素的合成途径第14-16页
        1.3.2 核黄素操纵子的结构第16-17页
    1.4 产核黄素B.subtilis工程菌的构建策略第17-20页
        1.4.1 诱变和基因组重排技术的运用第17-18页
        1.4.2 增强前体物的供应或削弱副产物的生成第18-19页
        1.4.3 过表达核黄素操纵子第19页
        1.4.4 其他的改造方法第19-20页
    1.5 本课题的研究内容和意义第20-21页
第二章 实验材料和方法第21-42页
    2.1 实验材料第21-28页
        2.1.1 菌种和质粒第21-22页
        2.1.2 主要仪器第22-23页
        2.1.3 实验试剂第23-24页
        2.1.4 主要溶液第24-25页
        2.1.5 主要培养基第25页
        2.1.6 PCR引物第25-28页
    2.2 实验方法第28-42页
        2.2.1 E.coli质粒的提取第28-29页
        2.2.2 B.subtilis基因组DNA的提取第29页
        2.2.3 E.coli感受态细胞的转化第29-30页
        2.2.4 B.subtilis的spizizen转化第30页
        2.2.5 单片段PCR扩增目的基因第30-32页
        2.2.6 融合PCR第32-35页
            2.2.6.1 一步法融合PCR第32-33页
            2.2.6.2 两步法融合PCR第33-35页
        2.2.7 PCR产物的纯化回收第35页
        2.2.8 PCR产物的胶回收第35-36页
        2.2.9 酶切体系第36页
        2.2.10 连接体系第36-37页
        2.2.11 琼脂糖凝胶电泳第37页
        2.2.12 菌种保藏第37-38页
        2.2.13 菌株的摇瓶发酵第38页
        2.2.14 发酵液中核黄素含量的测定第38页
        2.2.15 Marker-free基因操作方法第38-42页
            2.2.15.1 基于单交换同源重组的Marker-free基因操作方法第38-39页
            2.2.15.2 基于双交换同源重组的Marker-free基因操作方法第39-41页
            2.2.15.3 双交换同源重组的Marker-free基因操作方法的改进第41-42页
第三章 结果与讨论第42-76页
    3.1 B.subtilis高效重构系统的建立第42-69页
        3.1.1 upp作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的建立第42-48页
            3.1.1.1 SZ0中upp基因的敲除第42-44页
            3.1.1.2 重构系统的应用第44-48页
        3.1.2 araR作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的建立第48-54页
            3.1.2.1 Para-neo元件的构建第48-53页
            3.1.2.2 Para-neo元件的转化第53-54页
        3.1.3 araR作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的应用第54-62页
            3.1.3.1 FRX0中rbsK基因的敲除和gmk、ndk基因的过表达第54-57页
            3.1.3.2 FRX0中ypaA基因的敲除和ywlF基因的过表达第57-59页
            3.1.3.3 FRX0中xylR基因的敲除和prs基因的过表达第59-62页
        3.1.4 araR作为负筛选标记的枯草芽孢杆菌重构系统的改进第62-68页
            3.1.4.1 FRX0中cyd基因的敲除第62-65页
            3.1.4.2 FRX0中araB基因的敲除第65-68页
        3.1.5 各基因修饰操作在不同菌种里的叠加第68-69页
            3.1.5.1 FRX4中基因修饰操作的叠加第68页
            3.1.5.2 FRX6中基因修饰操作的叠加第68页
            3.1.5.3 FRX3中基因修饰操作的叠加第68页
            3.1.5.4 FRX10中基因修饰操作的叠加第68-69页
            3.1.5.5 FRX9中基因修饰操作的叠加第69页
    3.2 重组菌株的摇瓶发酵结果第69-70页
    3.3 单因素法初步优化摇瓶发酵培养基条件第70-76页
        3.3.1 对主要氮源的优化第71页
        3.3.2 对补充氮源的优化第71-73页
        3.3.3 TCA循环对B.subtilis核黄素产量的影响第73页
        3.3.4 氨基酸对核黄素合成的影响第73-74页
        3.3.5 核黄素前体代谢物对核黄素合成的影响第74-76页
第四章 结论第76-78页
参考文献第78-83页
致谢第83页

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