| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 非洲猪瘟的病原学特性 | 第11-16页 |
| 1.1.1 非洲猪瘟病毒的形态特征 | 第11页 |
| 1.1.2 非洲猪瘟病毒的理化特性 | 第11-12页 |
| 1.1.3 非洲猪瘟病毒的抗原性 | 第12页 |
| 1.1.4 非洲猪瘟病毒的免疫原性 | 第12-13页 |
| 1.1.5 非洲猪瘟病毒的增殖 | 第13页 |
| 1.1.6 非洲猪瘟病毒编码的主要蛋白及功能 | 第13-15页 |
| 1.1.7 非洲猪瘟病毒的宿主免疫逃避机制 | 第15-16页 |
| 1.2 非洲猪瘟的流行病学 | 第16-17页 |
| 1.3 非洲猪瘟的临床症状及病理变化 | 第17-18页 |
| 1.3.1 最急性型 | 第17页 |
| 1.3.2 急性型 | 第17页 |
| 1.3.3 亚急性型 | 第17页 |
| 1.3.4 慢性型 | 第17-18页 |
| 1.4 非洲猪瘟的诊断 | 第18-20页 |
| 1.4.1 病原检测方法 | 第18-19页 |
| 1.4.2 血清学检测方法 | 第19页 |
| 1.4.3 分子生物学检测方法 | 第19-20页 |
| 1.5 非洲猪瘟的防制 | 第20页 |
| 1.6 本研究的目的意义 | 第20-21页 |
| 2 材料 | 第21-27页 |
| 2.1 试验材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 菌株、载体及实验动物 | 第21页 |
| 2.1.2 主要培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第22页 |
| 2.2 主要仪器 | 第22页 |
| 2.3 主要溶液的配制方法 | 第22-27页 |
| 2.3.1 细菌培养液和培养基的配制方法 | 第22-23页 |
| 2.3.2 核酸电泳相关溶液的配制方法 | 第23-24页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE相关溶液的配制方法 | 第24-25页 |
| 2.3.4 Western Blot相关溶液的配制方法 | 第25页 |
| 2.3.5 蛋白纯化相关溶液的配制方法 | 第25-27页 |
| 3 试验方法 | 第27-43页 |
| 3.1 K205R基因的PCR扩增 | 第27-29页 |
| 3.1.1 K205R基因的获取 | 第27页 |
| 3.1.2 K205R基因扩增引物的设计 | 第27-28页 |
| 3.1.3 K205R基因的PCR扩增 | 第28页 |
| 3.1.4 K205R基因的凝胶回收 | 第28-29页 |
| 3.1.5 K205R基因片段的加“A”反应 | 第29页 |
| 3.2 重组质粒pMD18T-K205R的构建 | 第29-32页 |
| 3.2.1 感受态细胞(DH5α)的制备 | 第29-30页 |
| 3.2.2 重组质粒的连接 | 第30页 |
| 3.2.3 重组质粒的转化 | 第30页 |
| 3.2.4 重组子的筛选和鉴定 | 第30-32页 |
| 3.3 K205R基因的原核表达及其产物的纯化 | 第32-38页 |
| 3.3.1 BL21感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| 3.3.2 原核表达质粒pET32a-K205R的构建 | 第33-34页 |
| 3.3.3 酶切回收产物K205R基因和pET-32a的连接转化 | 第34页 |
| 3.3.4 pET32a-K205R重组表达质粒的筛选和鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3.5 重组质粒的原核表达 | 第35-36页 |
| 3.3.6 表达产物的检测 | 第36页 |
| 3.3.7 重组表达蛋白存在形式的鉴定 | 第36-37页 |
| 3.3.8 重组蛋白表达条件的优化 | 第37页 |
| 3.3.9 融合蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 3.4 重组蛋白的Western-Blot检测 | 第38-39页 |
| 3.5 兔抗pK205R蛋白血清的制备 | 第39页 |
| 3.5.1 重组蛋白抗原的制备 | 第39页 |
| 3.5.2 兔抗pK205R血清效价的测定 | 第39页 |
| 3.6 间接ELISA方法的建立及反应条件的优化 | 第39-42页 |
| 3.6.1 间接ELISA的操作步骤 | 第39-40页 |
| 3.6.2 抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定 | 第40页 |
| 3.6.3 抗原最适包被条件的确定 | 第40页 |
| 3.6.4 最适封闭液的确定 | 第40-41页 |
| 3.6.5 酶标二抗最适浓度的确定 | 第41页 |
| 3.6.6 血清最适反应时间的确定 | 第41页 |
| 3.6.7 酶标二抗最适反应时间的确定 | 第41页 |
| 3.6.8 底物最适显色时间的确定 | 第41页 |
| 3.6.9 阴阳性临界值的确定 | 第41-42页 |
| 3.7 间接ELISA抗体检测试剂盒的质量评价 | 第42-43页 |
| 3.7.1 特异性试验 | 第42页 |
| 3.7.2 敏感性试验 | 第42页 |
| 3.7.3 重复性试验 | 第42-43页 |
| 3.7.4 保质期试验 | 第43页 |
| 4 试验结果 | 第43-63页 |
| 4.1 K205R基因的克隆及表达载体的构建 | 第43-47页 |
| 4.1.1 K205R基因的PCR扩增 | 第43页 |
| 4.1.2 pMD18T-K205R质粒的鉴定 | 第43-45页 |
| 4.1.3 原核表达质粒pET32a-K205R的鉴定 | 第45-47页 |
| 4.2 pET32a-K205R质粒的原核表达 | 第47-51页 |
| 4.2.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第47-48页 |
| 4.2.2 重组蛋白存在形式的鉴定 | 第48页 |
| 4.2.3 重组蛋白表达条件的优化 | 第48-50页 |
| 4.2.4 重组蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 4.3 重组蛋白的Western-Blot检测 | 第51-52页 |
| 4.4 免疫兔血清的ELISA抗体效价的检测 | 第52-53页 |
| 4.5 间接ELISA方法的建立及反应条件的优化 | 第53-60页 |
| 4.5.1 抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定 | 第53-54页 |
| 4.5.2 抗原最适包被条件的确定 | 第54-55页 |
| 4.5.3 最适封闭液的确定 | 第55-57页 |
| 4.5.4 酶标二抗最适浓度的确定 | 第57-58页 |
| 4.5.5 血清最适反应时间的确定 | 第58页 |
| 4.5.6 酶标二抗最适反应时间的确定 | 第58-59页 |
| 4.5.7 底物最适显色时间的确定 | 第59-60页 |
| 4.5.8 阴阳性临界值的确定 | 第60页 |
| 4.6 间接ELISA抗体检测试剂盒的质量评价 | 第60-63页 |
| 4.6.1 特异性试验结果 | 第60页 |
| 4.6.2 敏感性试验结果 | 第60-61页 |
| 4.6.3 重复性试验结果 | 第61-62页 |
| 4.6.4 保质期试验 | 第62-63页 |
| 5 讨论 | 第63-65页 |
| 5.1 外源基因融合表达的意义 | 第63页 |
| 5.2 重组蛋白的制备 | 第63页 |
| 5.3 应用重组蛋白建立ELISA方法检测ASF的意义 | 第63-64页 |
| 5.4 ELISA建立条件的优化 | 第64-65页 |
| 5.5 ELISA试剂盒的组装和质量 | 第65页 |
| 6 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
