| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-19页 |
| 1.1 研究背景 | 第13-18页 |
| 1.1.1 鳞翅目昆虫的分子机理研究概况 | 第13-14页 |
| 1.1.2 Tet-On 3g调控系统简介 | 第14-15页 |
| 1.1.3 杆状病毒简介 | 第15-16页 |
| 1.1.4 2A肽简介 | 第16页 |
| 1.1.5 Piggy Bac转座子简介 | 第16-18页 |
| 1.2 目的和意义 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-43页 |
| 2.1 菌株、质粒以及细胞系 | 第19页 |
| 2.2 酶及试剂 | 第19-20页 |
| 2.3 溶液及培养基 | 第20-22页 |
| 2.4 引物 | 第22-23页 |
| 2.5 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid的构建 | 第23-29页 |
| 2.5.1 供体质粒p Fast Bac Dual-PTRE 3G-dnapol (突变kozak)- polyhedron-PIE1-EGFP-GUS的构建 | 第23-27页 |
| 2.5.2 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid的获得及PCR鉴定 | 第27-28页 |
| 2.5.3 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid转染Sf9细胞及观察 | 第28-29页 |
| 2.6 Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系的建立 | 第29-34页 |
| 2.6.1 Piggy Bac系统穿梭质粒p XL-Bac II-PIE1-Tet 3G -T2A- Neo R- HSV TKpoly(A)的构建 | 第29-30页 |
| 2.6.2 建立稳定表达转录激活子Tet on 3G的Sf9细胞系Sf9(PIE1-Tet on 3G) | 第30-31页 |
| 2.6.3 反转录PCR检测构建的Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系 | 第31-33页 |
| 2.6.4 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid转染Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞及荧光观察 | 第33-34页 |
| 2.7 Tet 3G蛋白在Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系中的表达检测及在Sf9细胞系中的瞬时转染表达检测 | 第34-39页 |
| 2.7.1 Western Blot 检测 Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系中 Tet on 3G 蛋白的表达情况 | 第34-36页 |
| 2.7.2 Western Blot检测p XL-Bac II-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)瞬时转染Sf9细胞系后Tet on 3G蛋白的表达情况 | 第36页 |
| 2.7.3 p XL-Bac II-hr5-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)的构建及瞬时转染Sf9细胞系后Tet on 3G蛋白的表达检测 | 第36-38页 |
| 2.7.4 pxlbac II-opie2-3FLAG-Tet 3g-sv40poly A和pxlbac II-opie2- Tet 3g-sv40poly A的构建及瞬时转染Sf9细胞系后Tet on 3G蛋白的表达检测 | 第38-39页 |
| 2.8 Sf9 (opie2-Tet on 3G)细胞系的建立 | 第39-41页 |
| 2.8.1 穿梭质粒pxlbac II-opie2-Tet 3G-opie2poly A-PIE1(age I) -Neo R- opgp64poly A的构建 | 第39-40页 |
| 2.8.2 共转染Ac KO EGFP PTRE 3G-lef3-Bacmid检测pxlbac II-opie2- Tet 3G-opie2poly A-PIE1(age I)-Neo R-opgp64poly A瞬时转染Sf9细胞系后Tet on3G蛋白的表达 | 第40页 |
| 2.8.3 建立稳定表达转录激活子Tet on 3G的Sf9细胞系Sf9(opie2- Tet on 3G) | 第40页 |
| 2.8.4 反转录PCR检测构建的Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞系 | 第40页 |
| 2.8.5 Western Blot检测Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞系中Tet on 3G蛋白的表达情况 | 第40页 |
| 2.8.6 AcKO EGFP PTRE 3G-lef3 Bacmid转染Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞及荧光观察 | 第40-41页 |
| 2.9 转基因粘虫品系的构建 | 第41-43页 |
| 2.9.1 注射用Piggy Bac穿梭质粒及编码Piggy Bac转座酶的质粒的制备 | 第41页 |
| 2.9.2 粘虫卵的收集处理 | 第41页 |
| 2.9.3 粘虫卵的显微注射 | 第41页 |
| 2.9.4 注射后粘虫卵的荧光观察及孵化数统计 | 第41页 |
| 2.9.5 PCR检测注射后粘虫卵中Piggy Bac转座酶基因的转录情况 | 第41-42页 |
| 2.9.6 粘虫胚胎注射p Easy Blunt-PBORF-EGFP后的荧光观察及WesternBlot检测 | 第42页 |
| 2.9.7 粘虫胚胎注射p Easy Blunt- PIE1-EGFP后的荧光观察 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-62页 |
| 3.1 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid的构建 | 第43-45页 |
| 3.1.1 p MD19 T（simple）-PTRE 3G的PCR鉴定 | 第43页 |
| 3.1.2 p Fast Bac Dual- PTRE 3G-dnapol(突变kozak)-polyhedrin-PIE1- EGFP-GUS的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 3.1.3 p Fast Bac Dual- PTRE 3G-dnapol(突变kozak)-polyhedrin-PIE1- EGFP-GUS的酶切鉴定 | 第44页 |
| 3.1.4 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid的PCR鉴定 | 第44-45页 |
| 3.1.5 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid和Ac EGFP Bacmid转染Sf9细胞分析 | 第45页 |
| 3.2 Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系的建立 | 第45-48页 |
| 3.2.1 p MD19 T（simple）-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R的PCR鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2.2 p XL-Bac II-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)的PCR鉴定 | 第46页 |
| 3.2.3 p XL-Bac II-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)的酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 3.2.4 反转录PCR检测构建的Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系 | 第47页 |
| 3.2.5 AcKO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid转染Sf9(PIE1-Tet on 3G)荧光观察分析 | 第47-48页 |
| 3.3 Tet on 3G蛋白在Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系中的表达检测及在Sf9细胞系中的瞬时转染表达检测 | 第48-54页 |
| 3.3.1 Sf9(PIE1-Tet on 3G)细胞系中Tet on 3G蛋白表达的Western Blot检测 | 第48页 |
| 3.3.2 p XL-Bac II-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)瞬时转染Sf9细胞后Tet on 3G蛋白表达的Western Blot检测 | 第48-49页 |
| 3.3.3 p XL-Bac II-hr5- PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)的PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 3.3.4 p XL-Bac II-hr5-PIE1-Tet 3G-T2A-Neo R-HSV TK poly(A)瞬时转染Sf9细胞后Tet on 3G蛋白表达的Western Blot检测 | 第50页 |
| 3.3.5 pxlbac II-opie2-3FLAG-Tet 3g-sv40poly A和pxlbac II-opie2- Tet3g-sv40poly A的PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 3.3.6 pxlbac II-opie2-3FLAG-Tet 3g-sv40poly A和pxlbac II-opie2- Tet 3g-sv40poly A瞬时转染Sf9细胞后Tet on 3G蛋白表达的Western Blot检测 | 第51-52页 |
| 3.3.7 共转染Ac KO EGFP PTRE 3G-dnapol Bacmid和pxlbac II-opie2- Tet3g-sv40poly A至Sf9细胞后荧光观察分析 | 第52-53页 |
| 3.3.8 共转染Ac KO EGFP PTRE 3G-lef3 Bacmid和pxlbac II-opie2-Tet3g-sv40poly A至Sf9细胞后荧光观察分析 | 第53-54页 |
| 3.4 Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞系的建立 | 第54-58页 |
| 3.4.1 pxlbac II-opie2-Tet 3G-opie2poly A-PIE1(age I)-Neo R- opgp64poly A的PCR鉴定 | 第54-55页 |
| 3.4.2 共转染Ac KO EGFP PTRE 3G-lef3 Bacmid和pxlbac II-opie2-Tet 3G-opie2poly A-PIE1(age I)-Neo R-opgp64poly A至Sf9细胞后荧光观察分析 | 第55-56页 |
| 3.4.3 反转录PCR检测构建的Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞系 | 第56页 |
| 3.4.4 Western Blot检测Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞系中Tet on 3G蛋白的表达情况 | 第56-57页 |
| 3.4.5 AcKO EGFP PTRE 3G-lef3 Bacmid转染Sf9(opie2-Tet on 3G)细胞后荧光观察分析 | 第57-58页 |
| 3.5 转基因粘虫品系的构建尝试 | 第58-62页 |
| 3.5.1 pxlbac II-opie2-Tet 3G-opie2poly A-PIE1(age I)-m Cherry- opgp64poly A的PCR鉴定 | 第58页 |
| 3.5.2 显微注射Piggy Bac穿梭质粒及编码Piggy Bac转座酶的质粒后粘虫卵的荧光观察 | 第58-59页 |
| 3.5.3 显微注射Piggy Bac相关质粒后粘虫胚胎的荧光率及孵化率统计 | 第59页 |
| 3.5.4 显微注射Piggy Bac穿梭质粒及编码Piggy Bac转座酶的质粒后粘虫初孵幼虫的荧光观察 | 第59-60页 |
| 3.5.5 反转录PCR检测粘虫胚胎注射Piggy Bac相关质粒后转座酶基因的转录 | 第60-61页 |
| 3.5.6 粘虫胚胎注射p Easy Blunt-PBORF-EGFP后的荧光观察及WesternBlot检测 | 第61页 |
| 3.5.7 粘虫胚胎注射p Easy Blunt-PIE1-EGFP后的荧光观察 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-65页 |
| 5 总结与展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
