| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-26页 |
| 1.1 D-苯丙氨酸简介 | 第13-14页 |
| 1.1.1 D-苯丙氨酸的应用 | 第13页 |
| 1.1.2 D-苯丙氨酸生产方法 | 第13-14页 |
| 1.2 苯丙氨酸脱氨酶（PAL）应用现状 | 第14-16页 |
| 1.2.1 治疗苯丙酮尿症 | 第15页 |
| 1.2.2 合成 L-苯丙氨酸 | 第15页 |
| 1.2.3 合成非天然芳香基丙氨酸 | 第15-16页 |
| 1.3 苯丙氨酸脱氨酶（PAL）研究进展 | 第16-20页 |
| 1.3.1 苯丙氨酸脱氨酶（PAL）的分布 | 第16页 |
| 1.3.2 苯丙氨酸脱氨酶的理化性质 | 第16-17页 |
| 1.3.3 MIO（5-Methylene-3,5-dihydroimidazol-4-one）依赖性酶的反应机制 | 第17-20页 |
| 1.4 酶分子改造的方法 | 第20-21页 |
| 1.4.1 定点突变 | 第20页 |
| 1.4.2 定向进化 | 第20-21页 |
| 1.4.3 半理性的分子改造 | 第21页 |
| 1.5 介孔硅材料固定化酶 | 第21-23页 |
| 1.5.1 介孔材料固定酶的方法 | 第22页 |
| 1.5.2 介孔材料对酶固定化的影响 | 第22-23页 |
| 1.6 本文主要研究内容 | 第23-26页 |
| 1.6.1 本文立题背景 | 第23-24页 |
| 1.6.2 研究思路与内容 | 第24-26页 |
| 第二章 RgPAL 的基因克隆、表达及酶学性质 | 第26-45页 |
| 2.1 引言 | 第26页 |
| 2.2 材料与方法 | 第26-34页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.2.2 分子操作 | 第28-30页 |
| 2.2.3 RgPAL 全长基因克隆 | 第30-33页 |
| 2.2.4 构建表达载体 pET-28-pal | 第33页 |
| 2.2.5 诱导表达 | 第33页 |
| 2.2.6 重组酶精制 | 第33页 |
| 2.2.7 酶活性检测 | 第33-34页 |
| 2.2.8 重组酶 RgPAL 的性质表征 | 第34页 |
| 2.3 结果与分析 | 第34-43页 |
| 2.3.1 R. glutinis 生长与产酶过程 | 第34-35页 |
| 2.3.2 RgPAL 的基因克隆 | 第35-37页 |
| 2.3.3 RgPAL 的氨基酸序列比对分析 | 第37-38页 |
| 2.3.4 RgPAL 的高效表达 | 第38-39页 |
| 2.3.5 重组 RgPAL 的纯化 | 第39-40页 |
| 2.3.6 重组 RgPAL 的分子大小 | 第40-41页 |
| 2.3.7 重组 RgPAL 的酶学性质 | 第41-43页 |
| 2.3.8 不同来源的 PALs 动力学参数 | 第43页 |
| 2.3.9 RgPAL 的底物特异性 | 第43页 |
| 2.4 本章小结 | 第43-45页 |
| 第三章 固定化 RgPAL 拆分消旋 DL-Phe 生产手性 D-Phe | 第45-57页 |
| 3.1 引言 | 第45页 |
| 3.2 材料与方法 | 第45-49页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第45-46页 |
| 3.2.2 重组酶的制备 | 第46页 |
| 3.2.3 MCM-41-RgPAL 的制备 | 第46-47页 |
| 3.2.4 载体 MCM-41 的化学改性 | 第47页 |
| 3.2.5 MCM-41-NH-GA-RgPAL 的制备 | 第47页 |
| 3.2.6 MCM-41-NH-GA- RgPAL 的酶学性质 | 第47页 |
| 3.2.7 填充床酶反应器的操作 | 第47-48页 |
| 3.2.8 D-Phe 和 L-Phe 的检测 | 第48页 |
| 3.2.9 数据处理 | 第48-49页 |
| 3.3 结果与分析 | 第49-55页 |
| 3.3.1 MCM-41 的载酶量及对酶活性的影响 | 第49页 |
| 3.3.2 MCM-41 化学改性对 RgPAL 固定化的影响 | 第49-50页 |
| 3.3.3 MCM-41-NH-GA-RgPAL 的酶学性质 | 第50-51页 |
| 3.3.4 MCM-41-NH-GA-RgPAL 的重复利用次数 | 第51-52页 |
| 3.3.5 填充床反应器（RPBR）与搅拌反应器拆分的比较 | 第52-53页 |
| 3.3.6 RPBR 操作过程优化 | 第53-54页 |
| 3.3.7 RPBR 的操作稳定性 | 第54-55页 |
| 3.3.8 RPBR 拆分过程放大 | 第55页 |
| 3.4 本章小结 | 第55-57页 |
| 第四章 基于结构和催化机制分子改造 RgPAL 最适反应 pH | 第57-68页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 材料与方法 | 第57-60页 |
| 4.2.1 实验菌株与载体 | 第57页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第57页 |
| 4.2.3 引物 | 第57-58页 |
| 4.2.4 培养基 | 第58页 |
| 4.2.5 实验仪器 | 第58页 |
| 4.2.6 定点突变的实验流程 | 第58-59页 |
| 4.2.7 突变蛋白的 His 标签亲和层析 | 第59页 |
| 4.2.8 圆二色谱分析 | 第59页 |
| 4.2.9 分子模拟 | 第59页 |
| 4.2.10 突变体拆分 DL-Phe 方法 | 第59-60页 |
| 4.2.11 酶活性检测 | 第60页 |
| 4.2.12 数据分析 | 第60页 |
| 4.3 结果与分析 | 第60-66页 |
| 4.3.1 RgPAL 执行的脱氨方式 | 第60-63页 |
| 4.3.2 136 和 137 位突变对酶活性的影响 | 第63-64页 |
| 4.3.3 pH 对 RgPAL-Q137E 活性的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.4 137 位 Glu 的负电荷对酶催化的影响 | 第65-66页 |
| 4.3.5 RgPAL-Q137E 对 DL-苯丙氨酸的拆分 | 第66页 |
| 4.4 本章小结 | 第66-68页 |
| 第五章 RgPAL 对β-苯丙氨酸脱氨的分子改造 | 第68-75页 |
| 5.1 引言 | 第68页 |
| 5.2 材料与方法 | 第68-69页 |
| 5.2.1 实验菌株和质粒 | 第68页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第68页 |
| 5.2.3 培养基 | 第68页 |
| 5.2.4 引物 | 第68-69页 |
| 5.2.5 主要仪器 | 第69页 |
| 5.2.6 定点突变的方法 | 第69页 |
| 5.2.7 突变蛋白的纯化 | 第69页 |
| 5.2.8 分子模拟 | 第69页 |
| 5.2.9 β-Phe 的检测 | 第69页 |
| 5.3 结果与分析 | 第69-74页 |
| 5.3.1 RgPAL 活性中心 110Loop 的结构特征 | 第69-70页 |
| 5.3.2 110Loop 的构象模拟 | 第70页 |
| 5.3.3 110Loop 的柔性操控 RgPAL 的区域选择性 | 第70-72页 |
| 5.3.4 β-lyase 反应机制推测 | 第72-73页 |
| 5.3.5 基于反应机制提高β-lyase 活性 | 第73-74页 |
| 5.4 本章小结 | 第74-75页 |
| 主要结论与展望 | 第75-77页 |
| 主要结论 | 第75页 |
| 展望 | 第75-77页 |
| 论文创新点 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第86页 |
