| 缩略语 | 第3-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-31页 |
| 1.1 立题背景 | 第13-14页 |
| 1.2 米曲霉生物学特性以及研究进展 | 第14-16页 |
| 1.2.1 米曲霉的生物学特性 | 第14-15页 |
| 1.2.2 米曲霉菌种选育研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3 曲霉属类丝状真菌作为细胞工厂研究进展 | 第16-29页 |
| 1.3.1 曲霉属真菌转化系统 | 第17-21页 |
| 1.3.2 提高蛋白质在曲霉中的表达策略 | 第21-29页 |
| 1.4 中性蛋白酶 | 第29-30页 |
| 1.5 主要的研究内容和意义 | 第30-31页 |
| 1.5.1 主要研究内容 | 第30页 |
| 1.5.2 研究意义 | 第30-31页 |
| 第2章 米曲霉孢子内细胞核的分析及单核孢子分离方法的建立 | 第31-48页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 材料 | 第31-33页 |
| 2.2.1 菌株 | 第31页 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 | 第31-32页 |
| 2.2.3 试剂 | 第32页 |
| 2.2.4 溶液与培养基 | 第32-33页 |
| 2.3 方法 | 第33-36页 |
| 2.3.1 孢子的收集 | 第33页 |
| 2.3.2 菌丝的培养 | 第33页 |
| 2.3.3 载玻片的处理 | 第33-34页 |
| 2.3.4 米曲霉3.951孢子DAPI荧光染色 | 第34页 |
| 2.3.5 DAPI荧光染色条件的优化 | 第34-35页 |
| 2.3.6 米曲霉孢子大小与米曲霉孢子内核数的关系分析 | 第35页 |
| 2.3.7 不同过滤方法得到单核孢子的百分率 | 第35页 |
| 2.3.8 流式细胞仪分析孢子内细胞核数量 | 第35页 |
| 2.3.9 采用不同孔径过滤膜过滤后紫外诱变致死率曲线 | 第35-36页 |
| 2.4 结果 | 第36-43页 |
| 2.4.1 DAPI荧光染色条件的优化 | 第36-39页 |
| 2.4.2 显微镜分析孢子大小与孢子内细胞核数目的关系 | 第39-40页 |
| 2.4.3 采用膜过滤后孢子细胞核数量的分布 | 第40-41页 |
| 2.4.4 A.oryzae 3.951与A.oryzae RIB40孢子大小的比较 | 第41-42页 |
| 2.4.5 A.oryzae 3.951孢子的流式细胞仪分析 | 第42-43页 |
| 2.4.6 A.oryzae 3.951孢子的紫外线照射存活率曲线 | 第43页 |
| 2.5 讨论 | 第43-46页 |
| 2.5.1 DAPI对细胞核染色的影响因素 | 第43-45页 |
| 2.5.2 分离单核孢子的方法 | 第45-46页 |
| 2.6 小结 | 第46-48页 |
| 2.6.1 DAPI荧光染色A.oryzae 3.951孢子内细胞核的条件优化 | 第46页 |
| 2.6.2 A.oryzae 3.951孢子内细胞核数量统计与分析 | 第46-47页 |
| 2.6.3 单核孢子膜分离方法的建立 | 第47-48页 |
| 第3章 米曲霉pyrG缺陷株的构建 | 第48-77页 |
| 3.1 引言 | 第48页 |
| 3.2 材料 | 第48-53页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第48-49页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第49-50页 |
| 3.2.3 试剂 | 第50页 |
| 3.2.4 溶液与培养基 | 第50-53页 |
| 3.3 方法 | 第53-62页 |
| 3.3.1 菌体的培养 | 第53页 |
| 3.3.2 5-FOA最小抑制浓度的确定 | 第53页 |
| 3.3.3 紫外诱变筛选A.oryzae 3.951 5-FOA抗性菌株 | 第53-54页 |
| 3.3.4 5-FOA抗性菌株的筛选 | 第54页 |
| 3.3.5 米曲霉3.951尿嘧啶依赖型突变株的筛选 | 第54页 |
| 3.3.6 pyrG基因突变株的筛选与鉴定 | 第54-57页 |
| 3.3.7 A.oryzae AS11稳定性研究 | 第57页 |
| 3.3.8 A.oryzae AS11与A.oryzae 3.951生长性能及产酶情况比较 | 第57-59页 |
| 3.3.9 绿色荧光蛋白的表达 | 第59-62页 |
| 3.4 结果 | 第62-73页 |
| 3.4.1 5-FOA最小抑制浓度的确定 | 第62页 |
| 3.4.2 5-FOA抗性菌株的筛选 | 第62-63页 |
| 3.4.3 米曲霉AS11 pyrG缺陷株的鉴定 | 第63-67页 |
| 3.4.4 A.oryzae AS11稳定性研究 | 第67-68页 |
| 3.4.5 A.oryzae AS11菌株的生物学特性 | 第68-69页 |
| 3.4.6 A.oryzae AS11中性蛋白酶活性分析 | 第69-71页 |
| 3.4.7 GFP表达 | 第71-73页 |
| 3.5 讨论 | 第73-76页 |
| 3.5.1 营养缺陷株的筛选 | 第73-74页 |
| 3.5.2 GFP蛋白的表达 | 第74-75页 |
| 3.5.3 米曲霉营养缺陷型选择性标记转化系统 | 第75-76页 |
| 3.6 小结 | 第76-77页 |
| 3.6.1 A.oryzae AS11 pyrG缺陷株的筛选 | 第76页 |
| 3.6.2 A.oryzae AS11与A.oryzae 3.951生长特性及产酶能力比较 | 第76页 |
| 3.6.3 绿色荧光蛋白的表达 | 第76-77页 |
| 第4章 自克隆中性蛋白酶工程菌构建 | 第77-93页 |
| 4.1 引言 | 第77页 |
| 4.2 材料 | 第77-81页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第77-79页 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 | 第79页 |
| 4.2.3 试剂 | 第79-80页 |
| 4.2.4 溶液与培养基 | 第80-81页 |
| 4.3 方法 | 第81-86页 |
| 4.3.1 大肠杆菌感受态的制备及转化 | 第81页 |
| 4.3.2 表达载体的酶切验证 | 第81页 |
| 4.3.3 表达载体pNP-npI,pNP-gpdA::npI的线性化 | 第81-82页 |
| 4.3.4 线性化载体的纯化 | 第82页 |
| 4.3.5 菌丝体的培养 | 第82页 |
| 4.3.6 表达载体pNP-npI,pNP-gpdA::npI的转化 | 第82-83页 |
| 4.3.7 氯酸钾最小抑制浓度的确定 | 第83页 |
| 4.3.8 转化子的筛选 | 第83-84页 |
| 4.3.9 硝酸盐缺失菌株的筛选 | 第84页 |
| 4.3.10 niaD缺失型工程菌的鉴定 | 第84-86页 |
| 4.3.11 中性蛋白酶活性分析 | 第86页 |
| 4.3.12 转化子的遗传稳定性 | 第86页 |
| 4.3 结果 | 第86-91页 |
| 4.3.1 表达载体的酶切验证 | 第86-87页 |
| 4.3.2 氯酸钾最小抑制浓度的确定 | 第87页 |
| 4.3.3 转化子的筛选 | 第87-88页 |
| 4.3.4 硝酸盐缺失型菌株的筛选 | 第88-89页 |
| 4.3.6 niaD缺失型工程菌的鉴定 | 第89-91页 |
| 4.3.7 酶活测定 | 第91页 |
| 4.5 讨论 | 第91-92页 |
| 4.6 小结 | 第92-93页 |
| 4.6.1 自克隆中性蛋白酶工程菌的构建 | 第92页 |
| 4.6.2 自克隆中性蛋白酶工程菌的中性蛋白酶酶活分析 | 第92-93页 |
| 结论和展望 | 第93-95页 |
| 主要研究结论 | 第93-94页 |
| 进一步的工作方向 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第109页 |
