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酱油工业菌株米曲霉3.951自克隆系统的构建

缩略语第3-5页
摘要第5-7页
ABSTRACT第7-8页
目录第9-13页
第1章 文献综述第13-31页
    1.1 立题背景第13-14页
    1.2 米曲霉生物学特性以及研究进展第14-16页
        1.2.1 米曲霉的生物学特性第14-15页
        1.2.2 米曲霉菌种选育研究进展第15-16页
    1.3 曲霉属类丝状真菌作为细胞工厂研究进展第16-29页
        1.3.1 曲霉属真菌转化系统第17-21页
        1.3.2 提高蛋白质在曲霉中的表达策略第21-29页
    1.4 中性蛋白酶第29-30页
    1.5 主要的研究内容和意义第30-31页
        1.5.1 主要研究内容第30页
        1.5.2 研究意义第30-31页
第2章 米曲霉孢子内细胞核的分析及单核孢子分离方法的建立第31-48页
    2.1 引言第31页
    2.2 材料第31-33页
        2.2.1 菌株第31页
        2.2.2 主要仪器与设备第31-32页
        2.2.3 试剂第32页
        2.2.4 溶液与培养基第32-33页
    2.3 方法第33-36页
        2.3.1 孢子的收集第33页
        2.3.2 菌丝的培养第33页
        2.3.3 载玻片的处理第33-34页
        2.3.4 米曲霉3.951孢子DAPI荧光染色第34页
        2.3.5 DAPI荧光染色条件的优化第34-35页
        2.3.6 米曲霉孢子大小与米曲霉孢子内核数的关系分析第35页
        2.3.7 不同过滤方法得到单核孢子的百分率第35页
        2.3.8 流式细胞仪分析孢子内细胞核数量第35页
        2.3.9 采用不同孔径过滤膜过滤后紫外诱变致死率曲线第35-36页
    2.4 结果第36-43页
        2.4.1 DAPI荧光染色条件的优化第36-39页
        2.4.2 显微镜分析孢子大小与孢子内细胞核数目的关系第39-40页
        2.4.3 采用膜过滤后孢子细胞核数量的分布第40-41页
        2.4.4 A.oryzae 3.951与A.oryzae RIB40孢子大小的比较第41-42页
        2.4.5 A.oryzae 3.951孢子的流式细胞仪分析第42-43页
        2.4.6 A.oryzae 3.951孢子的紫外线照射存活率曲线第43页
    2.5 讨论第43-46页
        2.5.1 DAPI对细胞核染色的影响因素第43-45页
        2.5.2 分离单核孢子的方法第45-46页
    2.6 小结第46-48页
        2.6.1 DAPI荧光染色A.oryzae 3.951孢子内细胞核的条件优化第46页
        2.6.2 A.oryzae 3.951孢子内细胞核数量统计与分析第46-47页
        2.6.3 单核孢子膜分离方法的建立第47-48页
第3章 米曲霉pyrG缺陷株的构建第48-77页
    3.1 引言第48页
    3.2 材料第48-53页
        3.2.1 菌株与质粒第48-49页
        3.2.2 主要仪器与设备第49-50页
        3.2.3 试剂第50页
        3.2.4 溶液与培养基第50-53页
    3.3 方法第53-62页
        3.3.1 菌体的培养第53页
        3.3.2 5-FOA最小抑制浓度的确定第53页
        3.3.3 紫外诱变筛选A.oryzae 3.951 5-FOA抗性菌株第53-54页
        3.3.4 5-FOA抗性菌株的筛选第54页
        3.3.5 米曲霉3.951尿嘧啶依赖型突变株的筛选第54页
        3.3.6 pyrG基因突变株的筛选与鉴定第54-57页
        3.3.7 A.oryzae AS11稳定性研究第57页
        3.3.8 A.oryzae AS11与A.oryzae 3.951生长性能及产酶情况比较第57-59页
        3.3.9 绿色荧光蛋白的表达第59-62页
    3.4 结果第62-73页
        3.4.1 5-FOA最小抑制浓度的确定第62页
        3.4.2 5-FOA抗性菌株的筛选第62-63页
        3.4.3 米曲霉AS11 pyrG缺陷株的鉴定第63-67页
        3.4.4 A.oryzae AS11稳定性研究第67-68页
        3.4.5 A.oryzae AS11菌株的生物学特性第68-69页
        3.4.6 A.oryzae AS11中性蛋白酶活性分析第69-71页
        3.4.7 GFP表达第71-73页
    3.5 讨论第73-76页
        3.5.1 营养缺陷株的筛选第73-74页
        3.5.2 GFP蛋白的表达第74-75页
        3.5.3 米曲霉营养缺陷型选择性标记转化系统第75-76页
    3.6 小结第76-77页
        3.6.1 A.oryzae AS11 pyrG缺陷株的筛选第76页
        3.6.2 A.oryzae AS11与A.oryzae 3.951生长特性及产酶能力比较第76页
        3.6.3 绿色荧光蛋白的表达第76-77页
第4章 自克隆中性蛋白酶工程菌构建第77-93页
    4.1 引言第77页
    4.2 材料第77-81页
        4.2.1 菌株与质粒第77-79页
        4.2.2 主要仪器与设备第79页
        4.2.3 试剂第79-80页
        4.2.4 溶液与培养基第80-81页
    4.3 方法第81-86页
        4.3.1 大肠杆菌感受态的制备及转化第81页
        4.3.2 表达载体的酶切验证第81页
        4.3.3 表达载体pNP-npI,pNP-gpdA::npI的线性化第81-82页
        4.3.4 线性化载体的纯化第82页
        4.3.5 菌丝体的培养第82页
        4.3.6 表达载体pNP-npI,pNP-gpdA::npI的转化第82-83页
        4.3.7 氯酸钾最小抑制浓度的确定第83页
        4.3.8 转化子的筛选第83-84页
        4.3.9 硝酸盐缺失菌株的筛选第84页
        4.3.10 niaD缺失型工程菌的鉴定第84-86页
        4.3.11 中性蛋白酶活性分析第86页
        4.3.12 转化子的遗传稳定性第86页
    4.3 结果第86-91页
        4.3.1 表达载体的酶切验证第86-87页
        4.3.2 氯酸钾最小抑制浓度的确定第87页
        4.3.3 转化子的筛选第87-88页
        4.3.4 硝酸盐缺失型菌株的筛选第88-89页
        4.3.6 niaD缺失型工程菌的鉴定第89-91页
        4.3.7 酶活测定第91页
    4.5 讨论第91-92页
    4.6 小结第92-93页
        4.6.1 自克隆中性蛋白酶工程菌的构建第92页
        4.6.2 自克隆中性蛋白酶工程菌的中性蛋白酶酶活分析第92-93页
结论和展望第93-95页
    主要研究结论第93-94页
    进一步的工作方向第94-95页
参考文献第95-108页
致谢第108-109页
攻读学位期间的研究成果第109页

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