| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第14-29页 |
| 1.1 脂肪酶/酯酶的简介 | 第14-17页 |
| 1.1.1 脂类水解酶 | 第14页 |
| 1.1.2 脂肪酶/酯酶的来源 | 第14页 |
| 1.1.3 脂肪酶/酯酶的区别 | 第14-15页 |
| 1.1.4 脂肪酶/酯酶的构造与催化机理 | 第15页 |
| 1.1.5 耐热酶热稳定性机制 | 第15-17页 |
| 1.2 脂肪酶/酯酶的基因挖掘 | 第17-18页 |
| 1.2.1 产酶原始菌株的筛选 | 第17-18页 |
| 1.2.2 基因组挖掘技术 | 第18页 |
| 1.3 脂肪酶/酯酶的异源表达 | 第18-21页 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 | 第18-19页 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第19页 |
| 1.3.3 信号肽影响蛋白异源表达 | 第19-20页 |
| 1.3.4 C-terminal His-tag对蛋白异源表达的影响 | 第20-21页 |
| 1.4 脂肪酶/酯酶的固定化 | 第21-23页 |
| 1.4.1 固定化技术与材料 | 第21-22页 |
| 1.4.2 固定化酶的特性 | 第22页 |
| 1.4.3 固定化酶的应用 | 第22-23页 |
| 1.5 固定化脂肪酶/酯酶在有机相合成生物柴油中的应用 | 第23-25页 |
| 1.5.1 有机相的选择 | 第23-24页 |
| 1.5.2 酶法催化合成生物柴油进展 | 第24-25页 |
| 1.6 全细胞脂肪酶/酯酶催化剂在非水相合成香料酯的研究 | 第25-26页 |
| 1.6.1 全细胞催化剂 | 第25-26页 |
| 1.6.2 酰基供体的选择 | 第26页 |
| 1.7 全细胞脂肪酶/酯酶催化剂降解除虫菊酯类农药的研究 | 第26-27页 |
| 1.7.1 脂肪酶/酯酶水相降解化合物研究 | 第26-27页 |
| 1.7.2 拟除虫菊酯类农药 | 第27页 |
| 1.8 本课题目的意义及研究内容 | 第27-29页 |
| 1.8.1 选题的目的意义 | 第27-28页 |
| 1.8.2 研究内容 | 第28-29页 |
| 第2章 脂肪酶/酯酶的基因克隆及重组质粒的构建 | 第29-47页 |
| 2.1 前言 | 第29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-34页 |
| 2.2.1 培养基及溶液的配制 | 第29-30页 |
| 2.2.2 菌种和质粒 | 第30-32页 |
| 2.2.3 分子生物学试剂盒和工具酶 | 第32-33页 |
| 2.2.4 实验试剂及仪器 | 第33-34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-42页 |
| 2.3.1 细菌基因组的提取 | 第34-35页 |
| 2.3.2 16SrDNA基因序列扩增 | 第35页 |
| 2.3.3 常用分析软件 | 第35页 |
| 2.3.4 实验过程用到引物 | 第35-38页 |
| 2.3.5 PCR扩增 | 第38页 |
| 2.3.6 核酸电泳凝胶回收 | 第38-39页 |
| 2.3.7 质粒DNA的提取 | 第39页 |
| 2.3.8 双酶切 | 第39-40页 |
| 2.3.9 连接酶切产物并转化 | 第40页 |
| 2.3.10 琼脂糖凝胶电泳 | 第40页 |
| 2.3.11 TA克隆 | 第40页 |
| 2.3.12 大肠杆菌感受态制备及转化 | 第40-41页 |
| 2.3.13 枯草芽孢杆菌感受态的制备方法及转化 | 第41页 |
| 2.3.14 菌种保藏 | 第41-42页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第42-46页 |
| 2.4.1 解淀粉芽孢杆菌来源的脂肪酶基因挖掘 | 第42-43页 |
| 2.4.2 产黄假单胞菌来源酯酶基因的挖掘 | 第43-44页 |
| 2.4.3 Geobacillus sp.和Paenibacillus polymyxa来源脂肪酶基因的获得与分析 | 第44-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第3章 解淀粉芽孢杆菌来源脂肪酶的异源表达、酶学性质探究 | 第47-60页 |
| 3.1 前言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料 | 第47-49页 |
| 3.2.1 常用试剂与仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.2 培养基与溶液 | 第48-49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-52页 |
| 3.3.1 重组菌的诱导表达及超声破碎 | 第49-50页 |
| 3.3.2 亲和层析纯化重组蛋白 | 第50页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳分析 | 第50页 |
| 3.3.4 重组脂肪酶酶活测定 | 第50-51页 |
| 3.3.5 酶反应动力学参数的测量 | 第51页 |
| 3.3.6 温度和pH对酶活的影响 | 第51-52页 |
| 3.3.7 金属离子和化学试剂对酶活的影响 | 第52页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第52-59页 |
| 3.4.1 脂肪酶LipBA序列分析 | 第52-54页 |
| 3.4.2 脂肪酶LipBA蛋白表达与纯化 | 第54-55页 |
| 3.4.3 脂肪酶LipBA最适温度与温度耐受性 | 第55-56页 |
| 3.4.4 脂肪酶LipBA最适pH与pH耐受性 | 第56-57页 |
| 3.4.5 金属离子和化学试剂对脂肪酶LipBA酶活的影响 | 第57-59页 |
| 3.5 本章小结 | 第59-60页 |
| 第4章 解淀粉芽孢杆菌脂肪酶LipBA合成生物柴油研究 | 第60-68页 |
| 4.1 前言 | 第60页 |
| 4.2 实验材料 | 第60-61页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第60-61页 |
| 4.2.2 常用化学试剂 | 第61页 |
| 4.3 实验方法 | 第61-62页 |
| 4.3.1 固定化脂肪酶条件优化 | 第61页 |
| 4.3.2 合成生物柴油反应体系 | 第61-62页 |
| 4.3.3 脂肪酶LipBA催化生物柴油最优条件确定 | 第62页 |
| 4.3.4 分析方法的确定 | 第62页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第62-67页 |
| 4.4.1 固定化脂肪酶条件优化 | 第62-63页 |
| 4.4.2 不同底物油脂对合成生物柴油转化率的影响 | 第63-64页 |
| 4.4.3 有机溶剂对合成生物柴油转化率的影响 | 第64-65页 |
| 4.4.4 反应温度对脂肪酸甲酯得率的影响 | 第65-66页 |
| 4.4.5 反应时间对脂肪酶合成生物柴油转化率的影响 | 第66-67页 |
| 4.5 本章小结 | 第67-68页 |
| 第5章 解淀粉芽孢杆菌脂肪酶LipBA催化合成香料酯的研究 | 第68-77页 |
| 5.1 前言 | 第68页 |
| 5.2 实验材料 | 第68-69页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第68页 |
| 5.2.2 常用化学试剂 | 第68-69页 |
| 5.3 实验方法 | 第69-71页 |
| 5.3.1 脂肪酶LipBA全细胞催化剂的准备 | 第69-70页 |
| 5.3.2 脂肪酶LipBA催化合成乙酸肉桂酯的条件优化 | 第70页 |
| 5.3.3 合成不同碳链长度肉桂醇酯的酰基供体选择 | 第70页 |
| 5.3.4 分析方法的确定 | 第70-71页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第71-76页 |
| 5.4.1 有机溶剂对肉桂醇转化率的影响 | 第71-72页 |
| 5.4.2 反应温度对酶法合成乙酸肉桂酯的影响 | 第72-73页 |
| 5.4.3 加酶量对催化合成乙酸肉桂酯的影响 | 第73-74页 |
| 5.4.4 底物摩尔比对合成乙酸肉桂酯的影响 | 第74-75页 |
| 5.4.5 不同酰基供体对肉桂醇转化率的影响 | 第75-76页 |
| 5.5 本章小结 | 第76-77页 |
| 第6章 产黄假单胞菌酯酶EstPS1酶学性质及降解农药研究 | 第77-92页 |
| 6.1 前言 | 第77页 |
| 6.2 实验材料 | 第77-79页 |
| 6.2.1 实验仪器 | 第77-78页 |
| 6.2.2 常用化学试剂 | 第78-79页 |
| 6.3 实验方法 | 第79-80页 |
| 6.3.1 酯酶EstPS1酶学性质的测定 | 第79页 |
| 6.3.2 信号肽和自转运结构域对酯酶EstPS1的影响 | 第79页 |
| 6.3.3 酯酶EstPS1热稳定性的研究 | 第79-80页 |
| 6.3.4 酯酶EstPS1降解环境农药的条件优化 | 第80页 |
| 6.3.5 分析方法的确定 | 第80页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第80-90页 |
| 6.4.1 酯酶EstPS1的序列分析 | 第80-82页 |
| 6.4.2 酯酶EstPS1的性质表征 | 第82-86页 |
| 6.4.3 信号肽和自转运结构域对酯酶EstPS1的影响 | 第86-90页 |
| 6.5 本章小结 | 第90-92页 |
| 第7章 Geobacillus subterraneus来源酯酶无溶剂催化合成香料酯 | 第92-102页 |
| 7.1 前言 | 第92页 |
| 7.2 实验材料 | 第92页 |
| 7.2.1 常用化学试剂 | 第92页 |
| 7.3 实验方法 | 第92-93页 |
| 7.3.1 酯酶EstGSU753异源表达和酶学性质测定 | 第92页 |
| 7.3.2 酯酶EstGSU753甲醇耐受性测定 | 第92页 |
| 7.3.3 酯酶EstGSU753无溶剂体系合成乙酸肉桂酯 | 第92-93页 |
| 7.3.4 产物分析方法 | 第93页 |
| 7.4 结果与讨论 | 第93-101页 |
| 7.4.1 酯酶EstGSU753基因序列分析 | 第93-94页 |
| 7.4.2 酯酶EstGSU753异源表达 | 第94页 |
| 7.4.3 酯酶EstGSU753酶学性质 | 第94-96页 |
| 7.4.4 酯酶EstGSU753甲醇耐受性 | 第96-97页 |
| 7.4.5 底物浓度和反应时间对转化率的影响 | 第97-98页 |
| 7.4.6 反应体系含水量对转化率的影响 | 第98-99页 |
| 7.4.7 全细胞催化剂加入量对转化率的影响 | 第99-101页 |
| 7.5 本章小结 | 第101-102页 |
| 第8章 总结与展望 | 第102-105页 |
| 8.1 总结 | 第102-103页 |
| 8.2 展望 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-115页 |
| 博士期间论文发表情况 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-118页 |
| 附录1 缩略词表 | 第118-119页 |
| 附录2 NCBI提交序列信息 | 第119-129页 |
| 附录3 未提交NCBI基因序列 | 第129-138页 |
