| 中文摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第12-13页 |
| 引言 | 第13-21页 |
| 1.1 选题依据 | 第13页 |
| 1.2 毕赤酵母的糖基化修饰改造研究 | 第13-20页 |
| 1.2.1 毕赤酵母的N-糖基化修饰改造研究 | 第13-17页 |
| 1.2.2 毕赤酵母的O-糖基化的修饰改造研究 | 第17-20页 |
| 1.3 研究设想 | 第20页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二部分 实验材料 | 第21-25页 |
| 2.1 质粒 | 第21页 |
| 2.2 菌株 | 第21页 |
| 2.3 工具酶、抗体及试剂 | 第21-22页 |
| 2.4 主要培养基 | 第22页 |
| 2.5 主要溶液 | 第22-25页 |
| 第三部分 实验方法 | 第25-47页 |
| 3.1 糖基工程酵母N-糖基化修饰的改造 | 第25-35页 |
| 3.1.1 抗HER2抗体在毕赤酵母4-32中的诱导表达及酶切分析 | 第25-27页 |
| 3.1.2 引物设计 | 第27页 |
| 3.1.3 目的基因的扩增 | 第27-28页 |
| 3.1.4 构建pPIZαA-STT3D表达载体 | 第28-29页 |
| 3.1.5 构建pGE-URA3-αA-STT3D表达载体 | 第29-30页 |
| 3.1.6 糖基工程酵母4-32HL-STT3D表达抗HER2抗体N-糖基化程度分析 | 第30-32页 |
| 3.1.7 糖基工程酵母4-32-GM-CSF的诱导表达、纯化及酶切分析 | 第32-33页 |
| 3.1.8糖基工程酵母4-32-GM-CSF-STT3D的诱导表达、纯化及藤切分析 | 第33-34页 |
| 3.1.9 测定STT3D对糖基工程酵母生长的影响 | 第34-35页 |
| 3.2 糖基工程酵母O-糖基化修饰的改造 | 第35-47页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第35-36页 |
| 3.2.2 报告蛋白G-CSF基因的扩增 | 第36页 |
| 3.2.3 构建pPICZ9-G-CSF报告蛋白表达载体 | 第36-37页 |
| 3.2.4 报告蛋白表达载体转化毕赤酵母JC307及筛选鉴定 | 第37-38页 |
| 3.2.5 靶向阻遏载体基因的扩增 | 第38-40页 |
| 3.2.6 构建pGE-D6-dcas9-pmt-gRNA靶向阻遏载体 | 第40-43页 |
| 3.2.7 构建pGE-D6-NLS-dcas9-pmt-gRNA靶向阻遏载体 | 第43-44页 |
| 3.2.8 靶向阻遏载体转化毕赤酵母JC307-G-CSF及诱导表达 | 第44-47页 |
| 第四部分 实验结果 | 第47-67页 |
| 4.1 酵母表达系统N-糖基化修饰的改造 | 第47-56页 |
| 4.1.1 表达抗HER2抗体的4-32-HL阳性克隆的筛选 | 第47页 |
| 4.1.2 酵母菌4-32-HL表达的抗HER2抗体酶切分析 | 第47-48页 |
| 4.1.3 STT3D基因的扩增 | 第48-49页 |
| 4.1.4 pGE-URA3-αA-STT3D表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 4.1.5 4-32-HL-STT3D阳性克隆的筛选 | 第50-51页 |
| 4.1.6 糖基工程酵母4-32-HL-STT3D表达的抗HER2抗体酶切分析 | 第51-52页 |
| 4.1.7 4-32-GM-CSF及4-32-GM-CSF-STT3D阳性菌株的筛选 | 第52-54页 |
| 4.1.8 糖基工程酵母4-32-GM-CSF及4-32-GM-CSF-STT3D表达的GM-CSF酶切分析 | 第54页 |
| 4.1.9 分析STT3D基因对酵母生长情况的影响 | 第54-56页 |
| 4.2 酵母表达系统O-糖基化修饰的改造 | 第56-67页 |
| 4.2.1 报告蛋白基因的扩增 | 第56页 |
| 4.2.2 pPICZ9-G-CSF报告蛋白表达载体的构建 | 第56-58页 |
| 4.2.3 靶向阻遏载体基因的扩增 | 第58页 |
| 4.2.4 pGE-D6-dcas9-pmt-gRNA靶向阻遏载体的构建 | 第58-60页 |
| 4.2.5 pGE-D6-NLS-dcas9-pmt-gRNA靶向阻遏载体的构建 | 第60-62页 |
| 4.2.6 报告蛋白在导入靶向阻遏载体的毕赤酵母中的诱导表达、纯化及脱盐 | 第62-63页 |
| 4.2.7 质谱分析报告蛋白G-CSF的O-糖基化情况 | 第63-67页 |
| 第五部分 讨论 | 第67-71页 |
| 5.1 糖基工程酵母N-糖基化修饰改造研究 | 第67-68页 |
| 5.2 糖基工程酵母O-糖基化修饰改造研究 | 第68-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 硕士期间发表论文 | 第77页 |
