| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 背景--纤维素、纤维素酶及丝状真菌里氏木霉研究进展 | 第10-29页 |
| ·纤维素酶的研究概况 | 第11-12页 |
| ·丝状真菌生产纤维素酶 | 第12-13页 |
| ·丝状真菌工业发酵方式 | 第12页 |
| ·丝状真菌模式菌株基因组分析 | 第12页 |
| ·丝状真菌表达体系 | 第12-13页 |
| ·T.reesei分子生物学研究进展 | 第13-16页 |
| ·基因克隆 | 第13页 |
| ·纤维二糖水解酶I(CBHD启动子 | 第13-14页 |
| ·丝状真菌生产蛋白 | 第14-16页 |
| ·T.reesei的遗传转化 | 第16-20页 |
| ·T.reesei的遗传转化方法 | 第16-18页 |
| ·选择性标记 | 第18-20页 |
| ·T.reesei诱导产纤维素酶的机理 | 第20-23页 |
| ·T.reesei中纤维素酶组分的改造 | 第23-27页 |
| ·理性设计在改造纤维素内切酶上的应用 | 第25-27页 |
| ·本文主要研究内容 | 第27-29页 |
| 第2章 材料与方法 | 第29-45页 |
| ·实验材料 | 第29-34页 |
| ·菌株及质粒 | 第29页 |
| ·培养基配方 | 第29-32页 |
| ·主要试剂 | 第32-33页 |
| ·引物序列 | 第33-34页 |
| ·实验主要仪器 | 第34页 |
| ·试验方法 | 第34-44页 |
| ·T.reesei菌丝的收集 | 第34页 |
| ·T.reesei基因组DNA的提取 | 第34-35页 |
| ·T.reesei RNA的提取 | 第35页 |
| ·PCR | 第35-37页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第37页 |
| ·DNA片段胶回收 | 第37-38页 |
| ·PCR产物加A反应 | 第38页 |
| ·T-A clone | 第38页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第38页 |
| ·质粒DNA的抽提 | 第38-39页 |
| ·DNA的酶切 | 第39页 |
| ·去除质粒酶切位点 | 第39页 |
| ·DNA的连接 | 第39页 |
| ·A.tumefaciens GV3101感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| ·电转A.tumefaciens GV3101感受态细胞 | 第40页 |
| ·A.tumefaciens GV3101结合转移 | 第40-41页 |
| ·T.reesei重组菌株的筛选及鉴定 | 第41页 |
| ·红色荧光蛋白检测 | 第41页 |
| ·探究红色荧光蛋白的表达与纤维素酶诱导剂的关系 | 第41页 |
| ·pNP标准曲线的测定 | 第41-42页 |
| ·pNPC测定葡聚糖外切酶CBHI活性的测定 | 第42页 |
| ·基因工程菌中性纤维素内切酶酶活测定 | 第42页 |
| ·葡萄糖标准曲线的绘制 | 第42页 |
| ·内切纤维素酶(CMCNa酶)活力的测定方法 | 第42-43页 |
| ·纤维素酶(FPA酶)活力的测定方法 | 第43页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第43-44页 |
| ·产酶(CMCase为主)发酵条件的优化 | 第44页 |
| ·实验过程中使用的生物学软件 | 第44-45页 |
| 第3章 里氏木霉表达系统的构建及报告基因红色荧光蛋白的异源表达 | 第45-55页 |
| ·二元质粒的构建 | 第45-48页 |
| ·构建随机插入二元质粒pWEF31 | 第45-46页 |
| ·构建定点插入二元质粒pWEF32 | 第46-48页 |
| ·红色荧光蛋白标记的二元载体构建及农杆菌转化 | 第48-51页 |
| ·红色荧光蛋白基因DsRed2的获得 | 第48页 |
| ·二元质粒pWEF31-red和pWEF32-red的构建 | 第48-49页 |
| ·二元质粒pWEF31-red和pWEF32-red电转A.tumefaciens GV3101 | 第49页 |
| ·pWEF31-red和pWEF32-red转化T.reesei Rut-C30 | 第49-50页 |
| ·同源整合转化子的检出及验证 | 第50-51页 |
| ·红色荧光蛋白在里氏木霉的表达 | 第51-52页 |
| ·探究在F1中红色荧光蛋白的表达与纤维素酶诱导剂的关系 | 第52-54页 |
| ·小结 | 第54-55页 |
| 第4章 中性纤维素内切酶基因工程菌构建 | 第55-63页 |
| ·中性纤维素酶基因工程菌40F的构建 | 第55-56页 |
| ·T.reesei RUT C30纤维素内切酶(EG2)基因的定点突变 | 第55-56页 |
| ·二元质粒pWEF31-δEG2的构建 | 第56页 |
| ·二元质粒pWEF31-δEG2转化T.reesei | 第56页 |
| ·中性纤维素酶基因工程菌52F的构建 | 第56-59页 |
| ·Humicola grisea var.thermoidea纤维素内切酶EG3基因的克隆 | 第57页 |
| ·二元质粒pWEF31-EG3的构建 | 第57页 |
| ·二元质粒pWEF31-EG3转化T.reesei | 第57-59页 |
| ·中性纤维素酶基因工程菌40F发酵条件的优化 | 第59-62页 |
| ·产酶发酵条件的优化 | 第59-60页 |
| ·补加碳源、氮源对菌体产酶的影响 | 第60-62页 |
| ·小结 | 第62-63页 |
| 第5章 结论与展望 | 第63-65页 |
| ·总结 | 第63页 |
| ·展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附录 | 第73页 |
