| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-24页 |
| ·缺氧诱导因子 | 第11页 |
| ·脯氨酰羟化酶家族 | 第11-12页 |
| ·PHD2简介 | 第12-17页 |
| ·PHD2的特性及结构 | 第12-13页 |
| ·PHD2的催化机制 | 第13-15页 |
| ·PHD2在国内外的研究进展 | 第15-17页 |
| ·PHD2与缺氧缺血性疾病的关系 | 第15-16页 |
| ·PHD2与肿瘤的关系 | 第16页 |
| ·PHD2的抑制剂 | 第16-17页 |
| ·基因克隆技术 | 第17-18页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第18-22页 |
| ·pET表达系统 | 第19-20页 |
| ·融合蛋白技术 | 第20-21页 |
| ·宿主菌的选择 | 第21-22页 |
| ·本论文的研究目的、内容与技术路线 | 第22-24页 |
| ·研究的目的与内容 | 第22-23页 |
| ·研究的技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2的构建 | 第24-35页 |
| ·材料 | 第24-26页 |
| ·质粒与菌株 | 第24页 |
| ·主要材料及试剂 | 第24页 |
| ·主要设备及仪器 | 第24-25页 |
| ·常用试剂的配制 | 第25-26页 |
| ·方法 | 第26-30页 |
| ·pET-43.1b(+)线性化载体的制备 | 第26页 |
| ·引物设计 | 第26-27页 |
| ·PHD2基因的扩增及鉴定 | 第27页 |
| ·线性化载体及PCR产物的纯化 | 第27-28页 |
| ·原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2的构建及鉴定 | 第28页 |
| ·大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| ·重组质粒转化E.coli DH5 α | 第29页 |
| ·重组质粒的提取 | 第29-30页 |
| ·pET-43.1b(+)-PHD2酶切鉴定 | 第30页 |
| ·结果 | 第30-32页 |
| ·PHD2基因的PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·PCR产物测序结果 | 第31页 |
| ·pET-43.1b(+)及pET-43.1b(+)-PHD2酶切鉴定 | 第31-32页 |
| ·讨论与分析 | 第32-34页 |
| ·表达载体的选择 | 第32-33页 |
| ·In-Fusion方法及引物的设 | 第33-34页 |
| ·In-Fusion克隆方法 | 第33页 |
| ·In-Fusion引物的设计 | 第33-34页 |
| ·本章小结 | 第34-35页 |
| 第三章 pET-43.1b(+)-PHD2在大肠杆菌中的诱导表达 | 第35-47页 |
| ·材料 | 第35-37页 |
| ·质粒与菌株 | 第35页 |
| ·主要材料及试剂 | 第35-36页 |
| ·主要设备及仪器 | 第36页 |
| ·常用培养基及溶液的配制 | 第36-37页 |
| ·方法 | 第37-42页 |
| ·pET-43.1b(+)-PHD2转化三种大肠杆菌 | 第37页 |
| ·pET-43.1b(+)-PHD2在大肠杆菌中诱导表达 | 第37-38页 |
| ·大肠杆菌蛋白的提取及样品制备 | 第38页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第38-39页 |
| ·蛋白样品的SDS-PAGE分析 | 第39-40页 |
| ·宿主菌及目的蛋白表达形式的确定 | 第40页 |
| ·pET-43.1b(+)-PHD2宿主菌的确定 | 第40页 |
| ·目的蛋白表达形式的确定 | 第40页 |
| ·目的蛋白的Western Blot鉴定 | 第40-41页 |
| ·目的蛋白诱导表达条件的优化 | 第41-42页 |
| ·诱导表达时间的优化 | 第41页 |
| ·诱导剂浓度的优化 | 第41页 |
| ·诱导表达温度的优化 | 第41-42页 |
| ·结果 | 第42-45页 |
| ·pET-43.1b(+)-PHD2表达菌株的确定 | 第42页 |
| ·重组蛋白表达形式 | 第42-43页 |
| ·Nus-PHD2融合蛋白的Western Blot鉴定 | 第43-44页 |
| ·BL21(DE3)/pET-43.1b(+)-PHD2诱导表达条件优化 | 第44-45页 |
| ·诱导表达时间的确定 | 第44页 |
| ·诱导剂浓度的确定 | 第44-45页 |
| ·诱导表达温度的确定 | 第45页 |
| ·讨论与分析 | 第45-46页 |
| ·融合标签对目的蛋白的影响 | 第45-46页 |
| ·重组蛋白的分析及鉴定 | 第46页 |
| ·本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 Nus-PHD2融合蛋白的纯化及活性分析 | 第47-55页 |
| ·材料 | 第47-48页 |
| ·菌株及HIF-1α肽段 | 第47页 |
| ·主要材料及试剂 | 第47页 |
| ·主要设备及仪器 | 第47-48页 |
| ·常用培养基及溶液的配制 | 第48页 |
| ·方法 | 第48-50页 |
| ·BL21(DE3)/pET-43.1b(+)-PHD2的诱导表达 | 第48页 |
| ·重组蛋白的提取 | 第48-49页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第49页 |
| ·融合蛋白的活性测定 | 第49-50页 |
| ·蛋白样品透析 | 第49页 |
| ·融合蛋白的活性测定 | 第49-50页 |
| ·结果 | 第50-53页 |
| ·Nus-PHD2融合蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| ·Nus-PHD2融合蛋白的活性测定 | 第51-53页 |
| ·讨论与分析 | 第53-54页 |
| ·基于His·Tag标签的蛋白纯化方法 | 第53页 |
| ·HIF-1α羟基化反应结果及其影响因素 | 第53-54页 |
| ·本章小结 | 第54-55页 |
| 结论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 附录A pCMV6-Entry-EGLN1质粒图谱及克隆区 | 第63-64页 |
| 附录B PHD2目的基因测序结果 | 第64-65页 |
| 附录C PHD2基因序列匹配结果 | 第65-66页 |
| 附录D pET-43.1b(+)载体图谱及克隆区 | 第66页 |
