| 致谢 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-19页 |
| ·应激的重要作用 | 第11页 |
| ·抗应激基因 Himp1 | 第11-16页 |
| ·Himp1 的介绍 | 第11页 |
| ·Himp1 基因的分布 | 第11页 |
| ·Himp1 基因的定位 | 第11-13页 |
| ·Himp1 基因定位的检测 | 第11-12页 |
| ·Himp1 的细胞定位的分析 | 第12-13页 |
| ·Himp1 基因的功能 | 第13-16页 |
| ·Himp1 基因的功能与 B 细胞的意义 | 第13页 |
| ·Himp1 基因对细胞增殖的作用 | 第13-14页 |
| ·Himp1 基因与细胞凋亡 | 第14-16页 |
| ·细胞凋亡的表现症状 | 第16页 |
| ·RNA 干扰技术 | 第16-19页 |
| ·RNA 干扰原理 | 第16-17页 |
| ·RNA 干扰的应用 | 第17-19页 |
| 2 引言 | 第19-20页 |
| 3 材料和方法 | 第20-39页 |
| ·试剂与仪器 | 第20页 |
| ·Himp1 基因的克隆 | 第20-29页 |
| ·鼠 Himp1 基因 356bp 的克隆 | 第20-23页 |
| ·鼠 Himp1 基因克隆引物设计与合成 | 第20页 |
| ·鼠肝脏总 RNA 的提取 | 第20-21页 |
| ·RNA 的检测 | 第21页 |
| ·RT-PCR 扩增 | 第21-22页 |
| ·PCR 产物切胶纯化 | 第22页 |
| ·连接反应 | 第22-23页 |
| ·制备感受态细胞大肠杆菌 DH5α (CaCl2法) | 第23页 |
| ·转化 | 第23页 |
| ·DNA 序列测定 | 第23页 |
| ·DNA 序列分析 | 第23页 |
| ·样品采集 | 第23页 |
| ·小鼠 Himp1 基因真核表达载体 pcDNA3.1(+)-Himp1 的构建与鉴定 | 第23-25页 |
| ·表达载体的纯化与扩增 | 第23-24页 |
| ·表达载体的质粒提取 | 第24页 |
| ·双酶切目的片断与表达载体 pcDNA3.1(+)的酶切回收 | 第24-25页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第25页 |
| ·重组质粒的转化和筛选 | 第25页 |
| ·重组质粒 pcDNA3.1(+)-Himp1 的鉴定 | 第25-26页 |
| ·重组质粒的提取 | 第25页 |
| ·重组质粒的菌液 PCR 鉴定 | 第25-26页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第26页 |
| ·重组表达质粒的序列测定 | 第26页 |
| ·测序结果分析 | 第26页 |
| ·猪 Himp1 基因 1134bp 的克隆 | 第26-28页 |
| ·猪 Himp1 基因克隆引物设计与合成 | 第26-27页 |
| ·猪肝脏总 RNA 的提取 | 第27页 |
| ·RT-PCR 扩增 | 第27页 |
| ·PCR 产物切胶纯化 | 第27页 |
| ·连接反应 | 第27页 |
| ·转化 | 第27页 |
| ·DNA 序列测定 | 第27页 |
| ·DNA 序列分析 | 第27页 |
| ·样品采集 | 第27-28页 |
| ·猪 Himp1 基因真核表达载体 pcDNA3.1(+)-Himp1 的构建与鉴定 | 第28-29页 |
| ·双酶切目的片断 Himp1 片段与表达载体 pcDNA3.1(+)酶切的胶回收 | 第28页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第28页 |
| ·重组质粒的转化 | 第28页 |
| ·重组质粒的提取 | 第28页 |
| ·重组质粒的菌液 PCR 鉴定 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第29页 |
| ·重组表达质粒的序列测定 | 第29页 |
| ·测序结果分析 | 第29页 |
| ·样品采集 | 第29页 |
| ·鼠 Himp1 基因功能的检测 | 第29-30页 |
| ·MTT 法检测 Himp1 基因转染 Hela 细胞后生长周期的影响 | 第29-30页 |
| ·Himp1 基因抗应激降低细胞凋亡的诱导与检测 | 第30页 |
| ·DNA Ladder 法检测 Himp1 基因在无水乙醇诱导细胞凋亡的抗应激作用 | 第30页 |
| ·用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 | 第30页 |
| ·鼠 Himp1 基因通过 dsRNA 的干扰和猪 Himp1 基因有效 siRNA 序列的筛选 | 第30-39页 |
| ·两端含 T7 启动子序列的 EGFP、Himp1 片段的制备 | 第30-31页 |
| ·Himp1 dsRNA 的制备 | 第31-33页 |
| ·Himp1 片段的扩增 | 第31页 |
| ·PCR 产物切胶纯化 | 第31页 |
| ·Himp1+T7promoter 片段的扩增 | 第31页 |
| ·PCR 产物纯化 | 第31-32页 |
| ·MEGAscript RNAi Kit 体外转录制备 Himp1 dsRNA | 第32-33页 |
| ·EGFP dsRNA 的制备 | 第33-34页 |
| ·EGFP 片段的扩增 | 第33页 |
| ·PCR 产物切胶纯化 | 第33页 |
| ·EGFP+T7promoter 片段的扩增 | 第33-34页 |
| ·PCR 产物纯化 | 第34页 |
| ·MEGAscript RNAi Kit 体外转录制备 EGFP dsRNA | 第34页 |
| ·细胞培养、细胞转染及荧光显微镜观察和 Real Time PCR 检测 mRNA | 第34-36页 |
| ·细胞培养 | 第34页 |
| ·EGFP 基因及其 dsRNA 转染 Hela cell 荧光显微镜观察 | 第34页 |
| ·Himp1 基因转染 Hela cell mRNA 的检测 | 第34-35页 |
| ·EGFP 和 Himp1 基因沉默后 mRNA 的检测 | 第35-36页 |
| ·猪 Himp1 基因有效 SiRNA 的筛选 | 第36-39页 |
| ·猪 Himp1 基因 siRNA 引物的设计与合成 | 第36-37页 |
| ·siRNA 工作液的配制 | 第37页 |
| ·siRNA 转染 Hela 细胞 | 第37页 |
| ·实时定量 PCR 检测 Hela 细胞内猪 Himp1 mRNA 的相对表达水平 | 第37-38页 |
| ·统计分析 | 第38-39页 |
| 4 结果与分析 | 第39-50页 |
| ·鼠 Himp1 基因的克隆 | 第39-41页 |
| ·鼠 Himp1 基因 RT-PCR 扩增 | 第39-40页 |
| ·鼠 pcDNA3.1(+)—Himp1 真核表达载体的构建与鉴定 | 第40页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第40页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第40-41页 |
| ·重组质粒的菌落 PCR 鉴定 | 第40-41页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第41页 |
| ·pcDNA3.1-Himp1 重组质粒的测序鉴定 | 第41页 |
| ·猪 Himp1 基因的克隆 | 第41-43页 |
| ·猪 Himp1 基因 RT-PCR 扩增 | 第41-42页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·重组质粒菌液 PCR 鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第43页 |
| ·pcDNA3.1-Himp1 重组质粒的测序鉴定 | 第43页 |
| ·Himp1 基因和 EGFP 基因 dsRNA 的制备 | 第43-44页 |
| ·Himp1 基因 dsRNA 的制备 | 第43-44页 |
| ·EGFP 基因 dsRNA 的制备 | 第44页 |
| ·Himp1 基因在 Hela 细胞中 mRNA 过表达 | 第44-47页 |
| ·dsRNA 介导的 EGFP 基因沉默 | 第45-46页 |
| ·Q-PCR 检测 dsRNA 介导的基因的 mRNA 沉默 | 第46-47页 |
| ·Himp1 基因的过表达能促进细胞的增殖 | 第47-49页 |
| ·MTT 法检测 Himp1 基因转染 Hela 细胞能够促进细胞的增殖 | 第47-48页 |
| ·DNA Ladder 法检测 Himp1 基因过表达能减少细胞的凋亡 | 第48-49页 |
| ·实时荧光定量 PCR 法筛选猪 Himp1 siRNA 有效序列 | 第49-50页 |
| 5 讨论 | 第50-52页 |
| 6 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| Abstract | 第57-58页 |
