| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 引言 | 第11-20页 |
| 第一部分 携带嵌合神经营养因子NGFpreproNTN和酪氨酸羟化酶TH重组腺病毒的构建 | 第20-58页 |
| 一、实验材料和方法 | 第20-41页 |
| 1. 实验材料 | 第20-25页 |
| ·基因、重组腺病毒系统和细胞 | 第20-22页 |
| ·工具酶及试剂 | 第22页 |
| ·引物 | 第22-25页 |
| 2. 实验方法 | 第25-41页 |
| ·重组穿梭质粒pShuttleCMV-wtNTN的构建 | 第25-26页 |
| ·嵌合神经营养因子基因NGFpreproNTN的合成及其重组穿梭质粒的构建 | 第26-27页 |
| ·重组穿梭质粒pShuttleCMV-HTH的构建 | 第27-28页 |
| ·同源重组将外源基因整合至腺病毒基因组中 | 第28-31页 |
| ·携带外源基因的重组腺病毒包装 | 第31-35页 |
| ·重组腺病毒的形态学观察 | 第35页 |
| ·RT-PCR检测重组病毒在Vero细胞中的转录 | 第35-36页 |
| ·免疫荧光检测三个外源基因分别在Vero细胞中的表达 | 第36-37页 |
| ·免疫印迹(Western Blot)检测成熟NTN的分泌 | 第37-38页 |
| ·鸡胚背根神经节培养实验 | 第38页 |
| ·胎鼠中脑多巴胺能神经元存活实验 | 第38-40页 |
| ·Ad-HTH的体外活性测定 | 第40-41页 |
| 二、实验结果与分析 | 第41-55页 |
| 1. wtNTN、NGFpreproNTN和HTH基因的克隆及其重组穿梭质粒的构建 | 第41-43页 |
| 2. 重组腺病毒Ad-wtNTN、Ad-NGFpreproNTN、Ad-HTH和Ad-Control的包装 | 第43-46页 |
| 3. 重组腺病毒外源插入基因在Vero细胞中的表达 | 第46-51页 |
| 4. NTN的体外活性测定 | 第51-53页 |
| 5. 毛细管电泳法检测TH酶催化L-tyrosine转化为L-DOPA | 第53-55页 |
| 三、讨论 | 第55-58页 |
| 第二部分 表达神经营养因子NGFpreproNTN和酪氨酸羟化酶TH双顺反子重组腺病毒的构建 | 第58-89页 |
| 一、实验材料和方法 | 第58-74页 |
| 1. 实验材料 | 第58-60页 |
| ·基因、重组腺病毒系统和细胞 | 第58-59页 |
| ·工具酶及试剂 | 第59页 |
| ·引物 | 第59-60页 |
| 2. 实验方法 | 第60-74页 |
| ·双顺反子表达盒及其重组穿梭质粒的构建 | 第60-64页 |
| ·双顺反子重组腺病毒的同源重组及鉴定 | 第64-65页 |
| ·双顺反子重组腺病毒的包装、扩增和纯化 | 第65-68页 |
| ·HJ326在Vero细胞中的表达检测 | 第68-71页 |
| ·HJ326表达NGFpreproNTN的体外活性测定 | 第71-73页 |
| ·毛细管电泳法对HJ326表达HTH的体外活性的测定 | 第73-74页 |
| 二、实验结果及分析 | 第74-87页 |
| 1. 双顺反子表达盒的构建及其穿梭质粒的构建 | 第74-75页 |
| 2. 双顺反子重组腺病毒(HJ326)的包装 | 第75-76页 |
| 3. HJ326氯化铯梯度离心纯化和透射电镜观察 | 第76-77页 |
| 4. HJ326在Vero细胞中的表达检测 | 第77-82页 |
| 5. HJ326表达NTN和HTH的体外活性测定 | 第82-87页 |
| 三、讨论 | 第87-89页 |
| 第三部分 恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立及组合基因治疗评价 | 第89-109页 |
| 一、实验材料及实验动物 | 第89-90页 |
| 1. 实验材料 | 第89-90页 |
| 2. 实验动物 | 第90页 |
| 二、实验方法 | 第90-96页 |
| 1. 恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立及有效性和时效性的评价 | 第90-93页 |
| ·恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立 | 第90-91页 |
| ·对所建动物模型进行评价 | 第91-93页 |
| 2. 利用HJ326和Ad-NGFpreproNTN对模型猴进行组合基因 | 第93-95页 |
| ·恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立 | 第93页 |
| ·核磁共振成像(MRI)定位尾状核、壳核和黑质 | 第93-95页 |
| ·立体定位注射对模型猴进行基因治疗 | 第95页 |
| 3. 基因治疗效果的评价 | 第95-96页 |
| ·行为改变和恢复观察 | 第95页 |
| ·阿扑吗啡诱导旋转实验 | 第95-96页 |
| ·免疫组化评价神经生理恢复 | 第96页 |
| 三、动物实验结果 | 第96-107页 |
| 1. 恒河猴单侧帕金森氏病模型的行为评价 | 第96-98页 |
| 2. 免疫组化和HE染色评价模型猴神经生理改变 | 第98-99页 |
| 3. 核磁共振成像定位注射靶点 | 第99-101页 |
| 4. 组合基因治疗效果的观察和评价 | 第101-107页 |
| 四、讨论 | 第107-109页 |
| 结论 | 第109-110页 |
| 展望 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-116页 |
| 论文综述 | 第116-126页 |
| 参考文献 | 第123-126页 |
| 附录 | 第126-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 研究生简历 | 第134-135页 |
