| 中文摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 材料与方法 | 第14-68页 |
| 材料 | 第14-29页 |
| 1.菌株 | 第14页 |
| 2.细胞株 | 第14页 |
| 3.实验动物 | 第14页 |
| 4.质粒载体 | 第14-22页 |
| 5.cDNA文库 | 第22页 |
| 6.工具酶、实验所需试剂及试剂盒 | 第22页 |
| 7.抗体 | 第22-23页 |
| 8.主要仪器及设备 | 第23页 |
| 9.扩增基因所使用的引物 | 第23-29页 |
| 方法 | 第29-68页 |
| 1.生物信息学分析RSB系列EST | 第29-30页 |
| 2.从人睾丸cDNA文库,用PCR技术扩增精子发生相关的新基因 | 第30页 |
| 3.Northern blot检测HSD-50在不同组织和不同生殖相关组织的表达情况 | 第30-31页 |
| 4.限制性内切酶酶切反应 | 第31页 |
| 5.玻璃奶法回收DNA片段 | 第31-32页 |
| 6.连接反应 | 第32页 |
| 7.感受态细菌的制备 | 第32-33页 |
| 8.转化 | 第33页 |
| 9.碱裂解法小量制备质粒DNA | 第33页 |
| 10.真核细胞转染用质粒DNA的提取及纯化 | 第33-34页 |
| 11.质粒DNA的大量制备 | 第34-35页 |
| 12.重组蛋白质的原核表达 | 第35-37页 |
| 13.蛋白质浓度测定 | 第37-38页 |
| 14.多克隆抗体的制备 | 第38页 |
| 15.酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度 | 第38-40页 |
| 16.免疫组化 | 第40页 |
| 17.免疫荧光 | 第40-41页 |
| 18.酵母双杂交系统 | 第41-49页 |
| 19.细胞培养、复苏、传代和冻存 | 第49页 |
| 20.真核细胞的转染 | 第49-50页 |
| 21.真核细胞总RNA的制备及逆转录 | 第50-51页 |
| 22.以质粒为基础的RNA干扰操作程序 | 第51-53页 |
| 23.Western blot分析 | 第53-54页 |
| 24.免疫共沉淀 | 第54-55页 |
| 25.HSD-50突变体的构建 | 第55-58页 |
| 26.信号传导通路的检测(委托基因组北方中心进行实验) | 第58-59页 |
| 27.委托上海睿星基因技术有限公司进行酵母双杂交筛选服务 | 第59-67页 |
| 28.委托上海吉凯基因化学技术有限公司进行针对MSD-50的SiRNA设计并合成 | 第67-68页 |
| HSD-50功能研究实验结果 | 第68-115页 |
| 1.新基因的扩增 | 第68-70页 |
| 2.HSD-50基因生物信息学分析 | 第70-82页 |
| 基本资料 | 第70-73页 |
| 1) EST来源 | 第70-71页 |
| 2) EST所在的大鼠mRNA序列 | 第71页 |
| 3) HSD-50基因序列 | 第71-72页 |
| 4) HSD-50蛋白质序列 | 第72页 |
| 5) HSD-50核苷酸与大鼠序列相似性比较 | 第72页 |
| 6) HSD-50蛋白质序列与大鼠蛋白质序列相似性比较 | 第72-73页 |
| 相关信息 | 第73-82页 |
| 1) HSD-50基因获取途径 | 第73页 |
| 2) HSD-50基因组定位及序列分析 | 第73-74页 |
| 3) BLAST搜索结果 | 第74-77页 |
| 4) 在ExPasy资源中使用prosearch同源性搜索结果 | 第77页 |
| 5) HSD-50蛋白保守结构域分析 | 第77-78页 |
| 6) HSD-50蛋白特性分析总结 | 第78-79页 |
| 7) HSD-50蛋白其他信息分析 | 第79-82页 |
| 3.NORTHERN BLOT检测HSD-50在不同组织和不同生殖相关组织中的表达 | 第82页 |
| 4.HSD-50大鼠同源基因多组织表达的分析结果 | 第82-83页 |
| 5.HSD-50的原核表达 | 第83-84页 |
| ·HSD-50原核表达载体的构建 | 第83页 |
| ·HSD-50原核表达载体的诱导表达： | 第83-84页 |
| 6.兔抗HSD-50多克隆抗体的制备 | 第84-87页 |
| ·特异性抗原肽的表达 | 第84-85页 |
| ·ELISA测定抗HSD-50多克隆抗体滴度 | 第85页 |
| ·Western-blot检测抗体特异性 | 第85-86页 |
| ·免疫动物的双侧睾丸组织病理切片观察 | 第86-87页 |
| 7.免疫组化检测HSD-50在人睾丸组织表达定位 | 第87页 |
| 8.HSD-50在精原细胞系GCl SPG中表达定位 | 第87-88页 |
| 9.酵母双杂筛选与HSD-50相互作用的蛋白质 | 第88-90页 |
| ·酵母菌Y190表型验证 | 第88-89页 |
| ·诱饵质粒的构建 | 第89页 |
| ·自激活检测实验 | 第89页 |
| ·筛选克隆数量分析 | 第89页 |
| ·筛选所得阳性克隆 | 第89-90页 |
| 10.委托上海睿星基因技术有限公司进行酵母双杂筛选结果 | 第90-92页 |
| 11.关丁HSD-50和BIK、TSAP6的真核表达载体的构建 | 第92-93页 |
| 12.免疫共沉淀验证HSD-50和BIK,TSAP6之间的相互作用 | 第93-94页 |
| 13.HSD-50和BIK之间的共定位研究 | 第94-95页 |
| 14.特异性针对HSD-50的RNAI质粒载体的构建 | 第95-98页 |
| ·HSD-50 RNAi载体的构建 | 第95-96页 |
| ·HSD-50干扰位点的设计 | 第95页 |
| ·HSD-50 RNAi实验进行的细胞系模型的选择 | 第95-96页 |
| ·HSD-50 基因的RNAi干扰质粒的构建 | 第96页 |
| ·pSilencer-AB／CD特异性干扰HSD-50表达的效率检测 | 第96-98页 |
| ·pSilencer-AB／CD特异性干扰外源性HSD-50的表达 | 第96-98页 |
| ·pSilencer-AB／CD特异性干扰内源性HSD-50的表达 | 第98页 |
| 15.HSD-50对外源性BIK的降解 | 第98-103页 |
| ·过表达HSD-50可以引起外源性BIK的降解 | 第98-99页 |
| ·HSD-50引起BIK降解的时间依赖性 | 第99-101页 |
| ·HSD-50引起BIK降解的剂量依赖性 | 第101页 |
| ·HSD-50特异性降解BIK,可被丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂Aprotinin抑制 | 第101-102页 |
| ·HSD-50特异性降解BIK,不能被蛋白酶体抑制剂pS341抑制 | 第102-103页 |
| 16.构建HSD-50的系列突变体进一步研究其降解BIK的活性变化 | 第103-107页 |
| ·构建一系列关于HSD-50的突变体 | 第103-104页 |
| ·构建这些突变体的理论基础 | 第104-106页 |
| ·突变体构建测序结果 | 第106-107页 |
| ·HSD-50各突变体降解BIK的研究 | 第107页 |
| 17.HSD-50对HEK293T细胞中内源性表达BIK的降解 | 第107-110页 |
| ·HSD-50调节HEK293T细胞中内源性BIK表达最变化的研究 | 第107-108页 |
| ·蛋门酶体抑制剂pS341诱导HEK293T细胞中内源性BIK表达的增加 | 第108-109页 |
| ·HSD-50对HEK293T细胞中内源性表达BIK的降解 | 第109页 |
| ·HSD-50对Bax和Bc12的作用研究 | 第109-110页 |
| 18.HSD-50对AP1信号通路的影响 | 第110-114页 |
| ·在PMA和离子霉素存在时,HSD-50对AP1信号通路的影响 | 第111-112页 |
| ·在无PMA和离子霉素存在时,HSD-50对AP1信号通路的影响 | 第112-114页 |
| 小结 | 第114-115页 |
| 讨论 | 第115-120页 |
| 一.扩增新基因并提交GENBANK数据库 | 第115页 |
| 二.应用生物信息学手段预测HSD-50基因及编码蛋白的基本特性 | 第115-116页 |
| 三.HSD-50为广谱表达.尤以睾丸组织最高 | 第116页 |
| 四.HSD-50主要表达在人精原细胞的胞浆中 | 第116页 |
| 五.HSD-50降解BCL-2家族促凋亡分子BIK | 第116-118页 |
| 六.BIK降解和泛素—蛋白酶体通路 | 第118-119页 |
| 七.BIK和生殖 | 第119页 |
| 总结 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-123页 |
| 综述1 | 第123-133页 |
| BCL-2家族成员对生精细胞凋亡的调节 | 第123-130页 |
| 精子的发生过程 | 第123-124页 |
| 精子发生过程中的凋亡事件发生 | 第124-126页 |
| 幼年动物第一波精子发生中的凋亡和成年动物精子发生中的凋亡不同 | 第126页 |
| Bcl-2家族主要成员在生殖细胞中的表达 | 第126-129页 |
| Bcl-2家族在精子发生过程中调控作用的几种机制 | 第129-130页 |
| 结语 | 第130页 |
| 参考文献 | 第130-133页 |
| 综述2 | 第133-145页 |
| RHOMBOID蛋白家族研究进展 | 第133-140页 |
| Rhomboid蛋白的发现 | 第133页 |
| Rhomboid家族蛋白的结构、功能特点及分类 | 第133-134页 |
| Rhomboid蛋白的种族分布 | 第134-136页 |
| Rhomboid蛋白酶催化的底物特点及其加工底物的过程 | 第136-137页 |
| Rhomboid家族蛋白功能研究的实验方案 | 第137-138页 |
| 重要的相关领域研究状况 | 第138-139页 |
| Rhomboid家族蛋白可能涉及的信号传导通路 | 第139-140页 |
| 讨论 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-145页 |
| 在学习过程中,尚完成下述各项实验 | 第145-165页 |
| 1.HSD-33、HSD-34、HSD-35、HSD-36原核表达载体的构建及诱导表达 | 第146-154页 |
| ·基因扩增 | 第146-149页 |
| ·原核表达载体的构建及诱导表达 | 第149-154页 |
| 2.从人不孕不育血清中鉴定导致免疫性不孕不育的抗精子抗体并鉴定其相应抗原 | 第154-160页 |
| ·材料和方法 | 第154页 |
| ·结果 | 第154-160页 |
| 3.针对MSD-50的SIRNA设计合成及效果检测 | 第160-162页 |
| ·针对MSD-50的SiRNA设计并合成 | 第160页 |
| ·针对MSD-50的SiRNA效果检测 | 第160-162页 |
| 4.DHHC1基因克隆、真核表达载体构建及定位研究 | 第162-165页 |
| ·背景 | 第162-163页 |
| ·DHHC1人和小鼠的蛋白质同源性 | 第163页 |
| ·人源的DHHC1真核表达载体的构建 | 第163页 |
| ·GFP-DHHC1在CHO细胞中的定位研究 | 第163-165页 |
| 英、汉名词缩写及对照 | 第165-167页 |
| 致谢 | 第167页 |
