| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-54页 |
| 第一章 cDNA文库的发展和应用 | 第14-22页 |
| 一、RNA制备 | 第14-15页 |
| 二、cDNA第一链的合成及改进 | 第15-16页 |
| 1、反转录酶的种类与选择优化 | 第15-16页 |
| 2、反转录引物的选择 | 第16页 |
| 三、cDNA第二链的合成 | 第16-17页 |
| 1、cDNA第二链的合成方法 | 第16-17页 |
| 2、提高双链DNA的合成效率 | 第17页 |
| 四、cDNA的分子克隆及发展 | 第17-18页 |
| 五、克隆载体的改造 | 第18-20页 |
| 1、质粒载体的改造 | 第18-19页 |
| 2、入噬菌体载体的改造 | 第19-20页 |
| 六、cDNA文库的应用 | 第20-21页 |
| 1、获得目的基因全长cDNA | 第20页 |
| 2、获得RFLP和SSR分子标记 | 第20-21页 |
| 3、基因结构分析 | 第21页 |
| 七、cDNA文库的发展 | 第21-22页 |
| 第二章 植物与病原物互作的相关基因 | 第22-37页 |
| 一、病原物无毒基因及其产物 | 第23-25页 |
| 1、细菌的无毒基因 | 第24页 |
| 2、病毒的无毒基因 | 第24页 |
| 3、真菌的无毒基因 | 第24-25页 |
| 二、植物R基因及其产物 | 第25-33页 |
| 1、R基因结构 | 第25-26页 |
| 2、植物抗病基因在染色体上的组织分布与分子进化 | 第26-28页 |
| 3、植物抗病基因功能分析 | 第28-29页 |
| ·R基因的专化性识别 | 第28页 |
| ·植物细胞中R蛋白的定位 | 第28-29页 |
| ·NBS-LRR的功能 | 第29页 |
| 4、R基因的信号传导 | 第29-33页 |
| 三、病原物hrp基因及其产物 | 第33-37页 |
| 1、hrp基因簇 | 第33-34页 |
| 2、harpin蛋白 | 第34-35页 |
| 3、harpin蛋白的受体HrBP1 | 第35-37页 |
| 第三章 植物抗病基因克隆策略 | 第37-43页 |
| 一、转座子标签技术 | 第37-38页 |
| 二、图位克隆技术 | 第38-39页 |
| 三、异源基因克隆法 | 第39页 |
| 四、基因差异表达克隆法 | 第39-43页 |
| 第四章 克隆基因的表达系统 | 第43-54页 |
| 一、原核表达体系 | 第43-44页 |
| 1、原核表达载体 | 第43页 |
| 2、原核表达产物检测 | 第43-44页 |
| 3、原核表达存在的缺陷 | 第44页 |
| 二、真核表达体系 | 第44-48页 |
| 1、酿酒酵母表达体系 | 第44-46页 |
| ·酿酒酵母表达系统的组成 | 第44-45页 |
| ·酿酒酵母表达系统的应用及前景 | 第45页 |
| ·酿酒酵母基因表达系统研究现状及其优缺点 | 第45-46页 |
| 2、转基因动物和植物 | 第46-48页 |
| 三、优化基因表达的关键因素 | 第48-54页 |
| 1、密码子最佳化(codon optimization) | 第48-49页 |
| 2、翻译终止效率 | 第49-50页 |
| 3、真核细胞中的异源蛋白表达 | 第50-51页 |
| 4、融合蛋白表达系统的重大突破 | 第51页 |
| 5、裂解融合蛋白以除去fusion tag | 第51-53页 |
| 6、表达蛋白的可溶性 | 第53页 |
| 7、表达蛋白的稳定性 | 第53-54页 |
| 第二部分 研究报告 | 第54-119页 |
| 第一章 簇毛麦叶片cDNA文库构建 | 第54-62页 |
| 一、材料与方法 | 第54-59页 |
| 1、植物材料 | 第54页 |
| 2、方法 | 第54-59页 |
| ·总RNA提取 | 第54-55页 |
| ·mRNA分离 | 第55-56页 |
| ·cDNA文库构建 | 第56-59页 |
| 二、结果 | 第59-61页 |
| 1、白粉菌诱导的簇毛麦叶片cDNA文库构建 | 第59-60页 |
| 2、文库筛选试验 | 第60-61页 |
| 三、讨论 | 第61-62页 |
| 第二章 小麦抗病相关基因的克隆与功能分析 | 第62-119页 |
| 一、材料与方法 | 第63-77页 |
| 1、材料 | 第63页 |
| ·植物材料 | 第63页 |
| ·载体和菌株 | 第63页 |
| 2、方法 | 第63-77页 |
| ·总RNA提取 | 第63页 |
| ·mRNA的分离 | 第63-64页 |
| ·SSH | 第64-67页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第67页 |
| ·第一链cDNA浓度定量 | 第67-68页 |
| ·PCR反应 | 第68页 |
| ·RACE(Rapid amplification of cDNA ends) | 第68-69页 |
| ·扩增产物的电泳分离、回收、克隆 | 第69-70页 |
| ·阳性克隆的测序 | 第70页 |
| ·核苷酸序列及蛋白一级、二级结构比较分析 | 第70页 |
| ·Southern杂交 | 第70-72页 |
| ·Northern杂交 | 第72-73页 |
| ·PAGE电泳和染色 | 第73-74页 |
| ·大肠杆菌表达载体构建 | 第74页 |
| ·表达载体转化入溶源性大肠杆菌BL21(DE3)及鉴定 | 第74页 |
| ·溶源菌BL21(DE3)中检测表达产物 | 第74页 |
| ·体外检测抗坏血酸过氧化物酶(TaAPX)基因活性 | 第74-75页 |
| ·APX活力测定 | 第75页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞的制备和低温保存 | 第75-76页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞的转化(醋酸锂法) | 第76页 |
| ·酿酒酵母转化子PCR法快速鉴定 | 第76页 |
| ·功能互补试验 | 第76-77页 |
| ·酵母RNA提取 | 第77页 |
| 二、结果与分析 | 第77-112页 |
| 1、利用RT-PCR克隆抗病相关序列 | 第77-85页 |
| ·利用兼并引物克隆抗病相关基因及其特征分析 | 第77-80页 |
| ·利用特异引物分离抗病相关基因及其特征分析 | 第80-85页 |
| 2、小麦-簇毛麦6VS／6AL易位系与扬麦5号叶片SSH文库构建 | 第85-88页 |
| ·、6VS／6AL易位系与扬麦5号叶片SSH文库的建立 | 第85-87页 |
| ·、SSH文库的差式筛选 | 第87-88页 |
| 3、小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX)的克隆与表达分析 | 第88-96页 |
| ·、TaAPX基因的cDNA克隆与序列分析 | 第88-92页 |
| ·pET-32(a)-TaAPX表达载体的构建及在BL21中的表达产物分析 | 第92-94页 |
| ·体外检测抗坏血酸过氧化物酶(Ta-APX)活性 | 第94-95页 |
| ·白粉病诱导后APX活力变化及TaAPX基因的表达分析 | 第95-96页 |
| 4、谷胱甘肽还原酶基因的克隆和表达分析 | 第96-107页 |
| ·易位系中谷胱甘肽还原酶(GR)基因全长克隆 | 第96-97页 |
| ·Hv-GR全长基因克隆及结构分析 | 第97-101页 |
| ·Hv-GR基因的表达分析 | 第101页 |
| ·酿酒酵母载体的构建及在酵母中表达 | 第101-102页 |
| ·酵母表达 | 第102-104页 |
| ·Hv-GR在突变体酿酒酵母中的功能互补试验 | 第104-105页 |
| ·融合载体的构建及瞬间表达 | 第105-107页 |
| 5、小麦LRR基因的克隆、表达以及应用 | 第107-112页 |
| ·cDNA克隆和测序 | 第107-108页 |
| ·Ta-LRR2表达分析 | 第108-109页 |
| ·Ta-LRR2的染色体定位 | 第109-111页 |
| ·作为分子标记检测Pm21基因 | 第111-112页 |
| 三、讨论 | 第112-119页 |
| 1、利用RT-PCR克隆抗病相关基因 | 第112-113页 |
| ·由兼并引物扩增得到的小麦基因 | 第112页 |
| ·根据EST设计特异引物得到的NBS-LRR基因片段 | 第112-113页 |
| 2、扬麦5号与6VS／6AL易位系叶片SSH文库构建及筛选 | 第113-115页 |
| 3、小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX) | 第115-116页 |
| 4、簇毛麦谷胱甘肽还原酶基因(Hv-GR) | 第116-117页 |
| 5、基于Ta-LRR2序列的与Pm21基因紧密连锁的RGAP标记的开发 | 第117-119页 |
| 全文结论 | 第119-121页 |
| 参考文献 | 第121-138页 |
| 附录 | 第138-142页 |
| 致谢 | 第142页 |
