| 摘要 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| 英文摘要 | 第8-9页 |
| 前言 | 第9-11页 |
| 试验技术路线 | 第11-13页 |
| 技术路线(一) | 第11-12页 |
| 技术路线(二) | 第12-13页 |
| 第一部分 高效分泌表达K5蛋白毕赤酵母菌株的筛选 | 第13-20页 |
| 材料与方法 | 第13-15页 |
| 一.主要实验材料 | 第13页 |
| 二.主要实验仪器 | 第13页 |
| 三.实验方法 | 第13-15页 |
| 1.表达载体(p819-8αK5)鉴定 | 第13页 |
| 2.p819-8αK5质粒转化毕赤酵母菌及高效表达菌株的筛选 | 第13-14页 |
| 3.高表达菌株的筛选及保存 | 第14-15页 |
| 实验结果 | 第15-18页 |
| 1.p819-8αK5表达载体鉴定 | 第15-16页 |
| 2.p819-8αK5质粒转化毕赤酵母GS115及高效表达菌株的筛选 | 第16-18页 |
| 讨论 | 第18-20页 |
| 第二部分 K5蛋白发酵条件及纯化工艺研究 | 第20-31页 |
| 材料与方法 | 第20-22页 |
| 一.主要实验材料和实验试剂 | 第20页 |
| 二.主要实验仪器 | 第20页 |
| 三.实验方法 | 第20-22页 |
| 1.发酵参数的优化 | 第20-21页 |
| 2.培养基的优化 | 第21页 |
| 3.K5蛋白的纯化 | 第21-22页 |
| 实验结果 | 第22-29页 |
| 1.发酵条件的优化结果 | 第22-24页 |
| 2.培养基种类的优化结果 | 第24-26页 |
| 3.K5蛋白的纯化 | 第26-29页 |
| 讨论 | 第29-31页 |
| 第三部分 K5蛋白质理化性质的检测及其生物学活性 | 第31-48页 |
| 材料与方法 | 第31-35页 |
| 一.主要实验材料和实验试剂 | 第31页 |
| 二.主要实验仪器 | 第31页 |
| 三.实验方法 | 第31-35页 |
| 1.K5蛋白理化性质的检测 | 第31-32页 |
| 2.K5蛋白生物学活性测定 | 第32-35页 |
| ·鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验 | 第32页 |
| ·血管内皮细胞增殖抑制试验 | 第32-33页 |
| ·K5蛋白对小鼠肿瘤模型中的移植廇生长抑制试验 | 第33-35页 |
| 实验结果 | 第35-47页 |
| 1.K5蛋白理化性质的测定结果 | 第35-38页 |
| 2.K5蛋白生物学活性测定结果 | 第38-47页 |
| ·鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验结果 | 第38-39页 |
| ·血管内皮细胞增殖抑制试验结果 | 第39-41页 |
| ·移植瘤生长抑制试验结果 | 第41-47页 |
| 讨论 | 第47-48页 |
| 第四部分 K5蛋白哺乳动物细胞分泌表达质粒的构建及活性检测 | 第48-58页 |
| 材料与方法 | 第48-52页 |
| 一.主要实验材料 | 第48页 |
| 二.实验仪器 | 第48页 |
| 三.实验方法 | 第48-52页 |
| 1.K5蛋白哺乳动物细胞分泌表达质粒的构建 | 第48-50页 |
| 2.pDV-K5质粒扩增及初步纯化 | 第50页 |
| 3.重组pDV-K5质粒稳定转染Hela细胞及体外分泌表达的鉴定 | 第50-51页 |
| 4.pDV-K5质粒对H22鼠源移植肿瘤的生长抑制试验 | 第51-52页 |
| 实验结果 | 第52-57页 |
| 1.K5蛋白哺乳动物细胞分泌表达质粒的构建结果 | 第52-53页 |
| 2.重组质粒pDV-K5稳定转染Hela细胞及目的蛋白分泌表达鉴定 | 第53-55页 |
| 3.pDV-K5质粒对H22鼠源移植肿瘤的生长抑制试验 | 第55-57页 |
| 讨论 | 第57-58页 |
| 总结 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-60页 |
| 综述 | 第60-74页 |
| 内源性肿瘤血管生成抑制剂及其药效研究进展 | 第60-74页 |
| 附录 | 第74-83页 |
| 附录一:p819-8αK5表达载体的测序结果 | 第74-75页 |
| 附录二:pMD18-T-K5质粒测序结果 | 第75-76页 |
| 附录三:溶液及培养基配方 | 第76-77页 |
| 附录四:ECV304内皮细胞增殖抑制试验酶标仪扫描结果 HUVEC内皮细胞增殖抑制试验酶标仪扫描结果 | 第77-78页 |
| 附录五:抗肿瘤治疗临床试验中的血管生成抑制剂 | 第78-79页 |
| 附录六:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第79-80页 |
| 附录七:Western免疫印迹 | 第80-81页 |
| 附录八:大肠杆菌感受态细胞的制备和转化及酵母电转感受态细胞的制备和转化 | 第81-82页 |
| 附录九:人遗传密码子利用频度表 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
