| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 1 前言 | 第12-25页 |
| 1．1 水稻条纹叶枯病的经济重要性 | 第12页 |
| 1．2 病害症状与寄主范围 | 第12-13页 |
| 1．2．1 病害的外部症状 | 第12-13页 |
| 1．2．2 病害的内部症状 | 第13页 |
| 1．2．3 寄主范围 | 第13页 |
| 1．3 病害的传毒介体与传毒特性 | 第13-14页 |
| 1．4 病原病毒及其特性 | 第14页 |
| 1．5 RSV的分子生物学 | 第14-18页 |
| 1．5．1 病毒基因组的结构与编码策略 | 第14-15页 |
| 1．5．2 病毒基因组的复制、转录与表达调控 | 第15-16页 |
| 1．5．3 病毒基因组的编码蛋白 | 第16-18页 |
| 1．5．3．1 RdRp | 第16页 |
| 1．5．3．2 其它可能编码蛋白 | 第16-17页 |
| 1．5．3．3 CP与SP | 第17-18页 |
| 1．6 农杆菌介导的水稻转基因技术研究 | 第18-24页 |
| 1．6．1 农杆菌介导的基因遗传转化方法 | 第19页 |
| 1．6．2 根癌农杆菌介导转化水稻等单子叶植物的尝试 | 第19-20页 |
| 1．6．3 影响根癌农杆菌介导转化水稻的因素 | 第20-21页 |
| 1．6．3．1 水稻的基因型 | 第20页 |
| 1．6．3．2 水稻起始材料的选择 | 第20页 |
| 1．6．3．3 Vir基因的诱导 | 第20-21页 |
| 1．6．3．4 其它因素 | 第21页 |
| 1．6．4 转化过程中的选择标记基因 | 第21页 |
| 1．6．5 转化过程中的基因沉默及其对策 | 第21-23页 |
| 1．6．5．1 转录水平的基因沉默 | 第22页 |
| 1．6．5．2 转录后水平的基因沉默 | 第22-23页 |
| 1．6．5．3 克服基因沉默的策略 | 第23页 |
| 1．6．6 根癌农杆菌介导转化植物的优点 | 第23-24页 |
| 1．7 本研究的目的与意义 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-41页 |
| 2．1 供试材料 | 第25-29页 |
| 2．1．1 毒源 | 第25页 |
| 2．1．2 水稻品种 | 第25页 |
| 2．1．3 菌株 | 第25页 |
| 2．1．4 载体 | 第25页 |
| 2．1．5 试剂及酶类 | 第25-28页 |
| 2．1．6 供试培养基的配置 | 第28-29页 |
| 2．1．6．1 细菌培养基 | 第28页 |
| 2．1．6．2 组织培养培养基 | 第28-29页 |
| 2．2 实验方法 | 第29-41页 |
| 2．2．1 CP、SP基因克隆 | 第29-32页 |
| 2．2．1．1 引物设计与合成 | 第29页 |
| 2．2．1．2 病叶总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 2．2．1．3 RT-PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2．2．1．4 琼脂糖凝胶电泳及DNA片段的回收 | 第31页 |
| 2．2．1．5 质粒连接 | 第31页 |
| 2．2．1．6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2．2．1．7 连接反应物对宿主感受态细胞的转化 | 第32页 |
| 2．2．1．8 质粒的提取 | 第32页 |
| 2．2．1．9 重组质粒的酶切鉴定 | 第32页 |
| 2．2．2 农杆菌介导的植物表达载体的构建 | 第32-36页 |
| 2．2．2．1 植物表达载体pCA1300-CP和pCA1300-SP的构建 | 第32-33页 |
| 2．2．2．2 转化农杆菌 | 第33-36页 |
| 2．2．3 根癌农杆菌介导转化水稻 | 第36-38页 |
| 2．2．3．1 水稻胚性愈伤组织的诱导 | 第36页 |
| 2．2．3．2 根癌农杆菌的培养 | 第36页 |
| 2．2．3．3 愈伤组织与根癌农杆菌的共培养转化 | 第36页 |
| 2．2．3．4 抗性愈伤的筛选 | 第36页 |
| 2．2．3．5 转基因植株的再生 | 第36页 |
| 2．2．3．6 外源片段整合的初步检测 | 第36-38页 |
| 2．2．3．7 RT-PCR Southern点杂交初步检测外源片段的转录 | 第38页 |
| 2．2．4 水稻条纹病毒北京双桥分离物（RSV-SQ）RNA4全序列分析 | 第38-41页 |
| 2．2．4．1 引物设计与合成 | 第38-39页 |
| 2．2．4．2 病叶总RNA的提取 | 第39页 |
| 2．2．4．3 RT-PCR扩增 | 第39-40页 |
| 2．2．4．4 克隆及测序 | 第40页 |
| 2．2．4．5 核苷酸序列分析 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-65页 |
| 3．1 CP、SP基因的PCR产物及重组克隆的筛选与鉴定 | 第41-42页 |
| 3．2 植物表达载体的构建及转化农杆菌 | 第42-44页 |
| 3．3 愈伤组织的诱导 | 第44页 |
| 3．4 抗性愈伤的筛选 | 第44页 |
| 3．5 转基因植株的再生、生根壮苗及移栽 | 第44-48页 |
| 3．6 外源片段整合的初步检测 | 第48-52页 |
| 3．6．1 地高辛标记探针的制备 | 第48页 |
| 3．6．2 转化植株的PCR分析 | 第48-50页 |
| 3．6．3 转化植株的Southern点杂交检测 | 第50-51页 |
| 3．6．4 RT-PCR Southern点杂交检测外源片段的转录 | 第51-52页 |
| 3．7 RNA4全长克隆及序列析 | 第52-65页 |
| 3．7．1 RT-PCR扩增 | 第52页 |
| 3．7．2 重组质粒的筛选与鉴定 | 第52-53页 |
| 3．7．3 核苷酸与氨基酸序列分析 | 第53-65页 |
| 4 讨论 | 第65-69页 |
| 4．1 植物表达载体的构建及转化农杆菌 | 第65页 |
| 4．2 影响农杆菌转化的因素 | 第65-66页 |
| 4．3 CP与SP基因功能 | 第66-67页 |
| 4．4 RNA4全序列分析 | 第67-69页 |
| 5 小结 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 附录1 英文缩写词和英汉对照 | 第80-83页 |
| 附录2 所用试剂和缓冲液的配置 | 第83-87页 |
| 附录3 攻读期间发表及投稿文章 | 第87-15页 |
| 图表目录 | 第15-87页 |
| 图1-1 RSV基因组结构和编码策略 | 第15-26页 |
| 图2-1 pGEM-T easy载体图谱及多克隆位点序列 | 第26-27页 |
| 图2-2 表达载体pCAMBIA1300多克隆酶切位点图谱 | 第27-29页 |
| 图2-3 RSV-CP、SP基因片段的RT-PCR克隆策略 | 第29-35页 |
| 图2-4 RSV-CP／SP基因的植物表达载体pCA1300-CP／SP的构建 | 第35-39页 |
| 图2-5 RSV-SQ NS4、NSvc4、IR片段的RT-PCR克隆策略 | 第39-41页 |
| 图3-1 CP、SP基因片段的RT-PCR扩增 | 第41页 |
| 图3-2 重组质粒的BamHⅠ／SacⅠ双酶切电泳图谱 | 第41-43页 |
| 图3-3 重组质粒pCA2301-CP／SP的BamHⅠ／SacⅠ、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切鉴定 | 第43页 |
| 图3-4 重组质粒pCA1300-CP／SP的BamHⅠ／SacⅠ、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切鉴定 | 第43-45页 |
| 图3-5 a-j为从愈伤组织的诱导到植株再生并移栽的全过程 | 第45-48页 |
| 图3-6 地高辛标记的探针琼脂糖电泳 | 第48-49页 |
| 图3-7 转CP基因植株DNA的PCR分析电泳图谱 | 第49页 |
| 图3-8 转SP基因植株DNA的PCR分析电泳图谱 | 第49-50页 |
| 图3-9 Southern点杂交检测再生植株中的目的片段CP基因 | 第50页 |
| 图3-10 Southern点杂交检测再生植株中的目的片段SP基因 | 第50-51页 |
| 图3-11 RT-PCR Southern点杂交检测SP基因的转录 | 第51页 |
| 图3-12 RT-PCR Southern点杂交检测CP基因的转录 | 第51-52页 |
| 图3-13 RSV-SQ RNA4全长分段克隆 | 第52-60页 |
| 图3-14 我国RSV-SQ与PJ、T、M、CX分离物RNA4核苷酸序列对比 | 第60-61页 |
| 图3-15 RSV-SQ与PJ、T、M、CX分离物NS4氨基酸序列对比 | 第61-62页 |
| 图3-16 RSV-SQ与PJ、T、M、CX分离物NSvc4氨基酸序列对比 | 第62-63页 |
| 图3-17 根据RSV 5个分离物RNA4全长序列同源性建立地系统进化数 | 第63页 |
| 图3-18 根据RSV 5个分离物NS4氨基酸序列同源性对比建立的系统进化树 | 第63页 |
| 图3-19 根据RSV 5个分离物NSvc4氨基酸序列同源性对比建立的系统进化树 | 第63-64页 |
| 图3-20 RNA4基因间隔区内两个可能的发夹结构 | 第64-18页 |
| 表1-1 水稻条纹病毒基因组编码蛋白的功能 | 第18-62页 |
| 表3-1 我国RSV-SQ分离物与PJ、T、M、CX分离物vRNA4 ORF、RNA4 IR和vcRNA4序列一致性比较 | 第62-63页 |
| 表3-2 已报道的RSV-PJ、T、M、CX五个分离物RNA4全长序列同源性比较 | 第63-87页 |
