| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第14-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-34页 |
| 1 p53基因研究概况 | 第16-29页 |
| 1.1 p53的认知过程 | 第16-17页 |
| 1.2 p53蛋白的结构 | 第17-20页 |
| 1.2.1 p53蛋白的基本结构 | 第17-18页 |
| 1.2.2 p53选择性剪接异构体 | 第18-20页 |
| 1.3 p53蛋白的功能 | 第20-22页 |
| 1.3.1 阻滞细胞周期 | 第20-21页 |
| 1.3.2 促进细胞凋亡 | 第21页 |
| 1.3.3 维持基因组稳定 | 第21-22页 |
| 1.4 p53的作用机制 | 第22-23页 |
| 1.5 p53功能的调节 | 第23页 |
| 1.6 p53蛋白抗病毒功能研究进展 | 第23-29页 |
| 1.6.1 在病毒复制背景下p53调节细胞凋亡 | 第23-25页 |
| 1.6.2 p53与先天性免疫 | 第25-28页 |
| 1.6.3 p53与获得性免疫 | 第28-29页 |
| 1.6.4 p53作为病毒对抗的靶标 | 第29页 |
| 2 鱼类p53基因研究概述 | 第29-30页 |
| 3 鳜病毒研究进展 | 第30-32页 |
| 3.1 传染性脾肾坏死病毒概述 | 第31-32页 |
| 3.2 鳜弹状病毒概述 | 第32页 |
| 4 本研究问题的由来、目的和意义 | 第32-34页 |
| 第二章 试验材料和试验方法 | 第34-62页 |
| 1 试验材料 | 第34-37页 |
| 1.1 实验鱼、细胞和病毒 | 第34页 |
| 1.2 实验主要试剂 | 第34-37页 |
| 1.2.1 细胞实验相关试剂 | 第34-35页 |
| 1.2.2 核酸提取相关试剂 | 第35页 |
| 1.2.3 PCR、反转录和荧光定量PCR相关试剂 | 第35页 |
| 1.2.4 载体构建相关试剂 | 第35页 |
| 1.2.5 免疫印迹相关试剂 | 第35-36页 |
| 1.2.6 其他试剂及配制 | 第36-37页 |
| 1.3 主要设备 | 第37页 |
| 2 试验方法 | 第37-62页 |
| 2.1 CPB细胞培养 | 第37-39页 |
| 2.1.1 细胞传代 | 第38页 |
| 2.1.2 细胞冻存 | 第38-39页 |
| 2.1.3 细胞解冻 | 第39页 |
| 2.2 DNA和RNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.1 DNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.2 RNA的提取 | 第40页 |
| 2.3 cDNA的合成 | 第40-41页 |
| 2.4 鳜p53基因核心区域的扩增 | 第41-43页 |
| 2.5 SMART cDNA第一链的合成 | 第43-44页 |
| 2.6 RACE-PCR扩增鳜p53cDNA末端 | 第44-46页 |
| 2.7 鳜p53基因组DNA的克隆 | 第46-48页 |
| 2.8 鳜p53序列生物信息学分析 | 第48页 |
| 2.9 鳜p53原核表达和兔多克隆抗体的制备 | 第48-52页 |
| 2.9.1 原核表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 2.9.2 重组蛋白的诱导表达与表达产物的鉴定 | 第49-51页 |
| 2.9.3 重组蛋白的纯化 | 第51页 |
| 2.9.4 鳜p53兔多克隆抗体的制备 | 第51-52页 |
| 2.9.5 间接ELISA方法检测抗血清效价 | 第52页 |
| 2.10 细胞和组织样品取样 | 第52-53页 |
| 2.10.1 细胞取样 | 第52-53页 |
| 2.10.2 鳜组织蛋白的提取 | 第53页 |
| 2.11 病毒滴度测定方法 | 第53页 |
| 2.12 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第53-54页 |
| 2.13 蛋白印迹(Western blotting)分析 | 第54-55页 |
| 2.14 CPB细胞和鳜鱼鱼体的病毒感染和样品收集 | 第55-56页 |
| 2.14.1 CPB细胞的病毒感染和样品收集 | 第55页 |
| 2.14.2 鳜鱼鱼体的病毒感染和样品收集 | 第55-56页 |
| 2.15 鳜p53及其异构体mRNA在不同组织中的表达 | 第56页 |
| 2.16 鳜p53RNA干扰载体的构建 | 第56-58页 |
| 2.17 初筛嘌呤霉素对CPB细胞的最低致死浓度 | 第58页 |
| 2.18 细胞瞬时与稳定转染 | 第58-59页 |
| 2.19 细胞生长曲线 | 第59页 |
| 2.20 鳜p53敲降细胞系的干扰效率的检测 | 第59页 |
| 2.21 鳜p53敲降细胞系对ISKNV和SCRV增殖复制的影响 | 第59-60页 |
| 2.22 病毒蛋白检测 | 第60页 |
| 2.23 细胞活力的测定 | 第60-61页 |
| 2.24 5-Fu处理CPB细胞对鳜p53蛋白的影响 | 第61页 |
| 2.25 5-Fu处理对ISKNV和SCRV病毒增殖复制的影响 | 第61页 |
| 2.26 统计分析 | 第61-62页 |
| 第三章 试验结果与分析 | 第62-92页 |
| 1 鳜肿瘤抑制基因p53的克隆、表达模式及其对病毒的响应研究 | 第62-73页 |
| 1.1 鳜p53中间片段扩增结果 | 第62页 |
| 1.2 鳜p53cDNA全长及推导的氨基酸序列 | 第62-65页 |
| 1.3 鳜p53与其他物种的同源性分析 | 第65-66页 |
| 1.4 鳜p53蛋白的诱导表达 | 第66-67页 |
| 1.5 鳜p53兔多抗血清效价 | 第67页 |
| 1.6 鳜p53兔多克隆抗体纯化 | 第67-68页 |
| 1.6.1 紫外分光光度计检测鳜p53抗体浓度 | 第67-68页 |
| 1.6.2 ELISA方法检测纯化抗体滴度 | 第68页 |
| 1.7 鳜p53兔多抗的Western blotting检测 | 第68-70页 |
| 1.8 鳜p53在健康鳜各个组织中的表达 | 第70-71页 |
| 1.9 鳜p53在病毒感染后的表达谱 | 第71-73页 |
| 1.9.1 鳜p53在ISKNV感染后的表达谱 | 第71页 |
| 1.9.2 鳜p53在SCRV感染后的表达谱 | 第71-73页 |
| 2 鳜p53的基因组结构特征 | 第73-76页 |
| 2.1 鳜肿瘤抑制基因p53的基因结构分析 | 第73-76页 |
| 2.2 鳜p53蛋白5个高度保守区域在基因组上的位置分析 | 第76页 |
| 3 鳜p53选择性剪接异构体的克隆及其对病毒的响应研究 | 第76-82页 |
| 3.1 鳜p53选择性剪接异构体的cDNA全长及推导的氨基酸序列 | 第76-79页 |
| 3.2 Sc-p53I6在健康鳜各个组织中的表达 | 第79-80页 |
| 3.3 Sc-p53I6在病毒感染后的表达谱 | 第80-82页 |
| 3.3.1 Sc-p53I6在ISKNV感染后的表达谱 | 第80-81页 |
| 3.3.2 Sc-p53I6在SCRV感染后的表达谱 | 第81-82页 |
| 4 鳜p53敲降CPB细胞系的建立及其对ISKNV和SCRV增殖复制的影响 | 第82-88页 |
| 4.1 pMAGic7.1载体的酶切鉴定结果 | 第82页 |
| 4.2 pMAGic7.1-p53质粒的酶切鉴定 | 第82-83页 |
| 4.3 鳜p53敲降CPB细胞系的建立 | 第83-84页 |
| 4.4 细胞生长曲线 | 第84-85页 |
| 4.5 鳜p53敲降CPB细胞系mRNA表达变化 | 第85页 |
| 4.6 鳜p53敲降CPB细胞系的蛋白表达变化 | 第85-86页 |
| 4.7 鳜p53敲降CPB细胞系对细胞内病毒增殖复制的影响 | 第86-88页 |
| 4.7.1 鳜p53敲降CPB细胞系对细胞内ISKNV增殖复制的影响 | 第86-87页 |
| 4.7.2 鳜p53敲降CPB细胞系对细胞内SCRV增殖复制的影响 | 第87-88页 |
| 5 促进鳜p53表达对ISKNV和SCRV增殖复制的影响 | 第88-92页 |
| 5.1 5-氟尿嘧啶(5-Fu)对CPB细胞活力的影响 | 第88-89页 |
| 5.2 5-Fu处理CPB细胞p53蛋白表达情况 | 第89页 |
| 5.3 5-Fu处理CPB细胞对病毒增殖复制的影响 | 第89-92页 |
| 5.3.1 5-Fu处理CPB细胞对ISKNV增殖复制的影响 | 第89-90页 |
| 5.3.2 5-Fu处理CPB细胞对SCRV增殖复制的影响 | 第90-92页 |
| 第四章 讨论 | 第92-97页 |
| 全文总结 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-118页 |
| 作者简历 | 第118-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
