| 摘要 | 第2-3页 |
| abstract | 第3页 |
| 引言 | 第6-8页 |
| 1 实验材料 | 第8-13页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第8页 |
| 1.2 细胞株 | 第8-9页 |
| 1.3 实验小鼠 | 第9页 |
| 1.4 主要试剂 | 第9页 |
| 1.5 主要仪器设备 | 第9-10页 |
| 1.6 主要溶液配方 | 第10-13页 |
| 1.6.1 大肠杆菌(E.coli)培养基的配制 | 第10页 |
| 1.6.2 质粒DNA提取(大量法)相关溶液的配制 | 第10页 |
| 1.6.3 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及1%琼脂糖凝胶的配制 | 第10页 |
| 1.6.4 细胞冻存液及细胞裂解液的配制 | 第10-11页 |
| 1.6.5 SDS-PAGE配置蛋白胶及相关缓冲液的配制 | 第11页 |
| 1.6.6 Westernblotting相关缓冲液的配制 | 第11-12页 |
| 1.6.7 蛋白纯化相关缓冲液配制 | 第12页 |
| 1.6.8 常用缓冲液的配制 | 第12-13页 |
| 2 实验方法 | 第13-26页 |
| 2.1 基因表达载体的构建 | 第13-20页 |
| 2.1.1 蛋白序列的密码子优化 | 第13页 |
| 2.1.2 引物设计 | 第13页 |
| 2.1.3 引物稀释 | 第13页 |
| 2.1.4 PCR扩增 | 第13-14页 |
| 2.1.5 PCR产物回收 | 第14页 |
| 2.1.6 S1目的基因与载体的双酶切消化 | 第14-16页 |
| 2.1.7 双酶切产物纯化回收 | 第16页 |
| 2.1.8 目的基因与pEAK13CD5LTEVIgGhFc真核表达载体的连接 | 第16-17页 |
| 2.1.9 重组质粒的转化 | 第17页 |
| 2.1.10 重组质粒DNA的小量提取与鉴定 | 第17-19页 |
| 2.1.11 重组质粒DNA的大量提取 | 第19-20页 |
| 2.1.12 重组质粒DNA酶切线性化及纯化回收 | 第20页 |
| 2.2 细胞实验 | 第20-24页 |
| 2.2.1 HEK293T和HEK293E细胞的复苏 | 第20-21页 |
| 2.2.2 HEK293T和HEK293E细胞的传代 | 第21页 |
| 2.2.3 pEAK13CD5LS1TEVIgGFc表达质粒瞬时转染HEK293T细胞 | 第21页 |
| 2.2.4 稳定表达细胞株的构建 | 第21-22页 |
| 2.2.5 细胞裂解 | 第22页 |
| 2.2.6 Westernblotting检测 | 第22-23页 |
| 2.2.7 细胞冻存 | 第23页 |
| 2.2.8 蛋白纯化 | 第23-24页 |
| 2.2.9 BCA法测定蛋白质浓度 | 第24页 |
| 2.3 动物实验 | 第24-25页 |
| 2.4 免疫实验 | 第25-26页 |
| 2.4.1 Westernblotting验证接种小鼠是否产生抗S1血清 | 第25页 |
| 2.4.2 ELISA检测抗S1血清滴度 | 第25-26页 |
| 3 实验结果 | 第26-44页 |
| 3.1 MERS-CoV刺突蛋白(S)编码基因序列的密码子优化 | 第26-28页 |
| 3.2 MERS-CoVS1亚基基因片段PCR扩增 | 第28-29页 |
| 3.3 pEAK13CD5LTEVIgGFc表达载体与S1基因片段的酶切纯化回收 | 第29页 |
| 3.4 小量提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒鉴定 | 第29-30页 |
| 3.5 重组质粒的双酶切验证 | 第30-31页 |
| 3.6 重组质粒序列分析 | 第31-36页 |
| 3.7 大量提取pEAK13CD5LS1TEVIgGFc重组质粒鉴定 | 第36页 |
| 3.8 重组表达质粒瞬时转染HEK293T后的蛋白表达鉴定 | 第36-37页 |
| 3.9 重组质粒的酶切线性化验证 | 第37-38页 |
| 3.10 稳定表达细胞株的筛选鉴定 | 第38-39页 |
| 3.11 S1-Fc融合蛋白纯化后PAGE胶检测结果 | 第39-40页 |
| 3.12 Westernblotting验证抗S1血清的特异性 | 第40-42页 |
| 3.13 ELISA检测小鼠抗S1血清的高滴度 | 第42-44页 |
| 4 结论 | 第44-45页 |
| 4.1 成功构建重组质粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc | 第44页 |
| 4.2 在人源HEK293E细胞中成功表达了S1-Fc融合蛋白 | 第44页 |
| 4.3 Westernblotting和ELISA检测到小鼠抗血清对重组S1-Fc融合蛋白具高度特异性 | 第44-45页 |
| 5 讨论 | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-49页 |
| 综述 | 第49-62页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 附录或缩略词表 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第64-65页 |
