| 符号说明 | 第4-5页 |
| 目录 | 第5-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-23页 |
| 1.1 转录因子 | 第13-14页 |
| 1.2 WRKY转录因子的起源与进化 | 第14页 |
| 1.3 WRKY转录因子的结构特点 | 第14-15页 |
| 1.4 WRKY转录因子的分类 | 第15-17页 |
| 1.5 WRKY转录因子与W-box结合 | 第17页 |
| 1.6 WRKY转录因子的表达特点 | 第17-18页 |
| 1.7 WRKY转录因子的生物学功能 | 第18-22页 |
| 1.7.1 WRKY转录因子在植物抗病防卫反应的作用 | 第18-20页 |
| 1.7.2 WRKY转录因子调控植物的非生物胁迫应答反应 | 第20-21页 |
| 1.7.3 WRKY转录因子在植物生长发育中的作用 | 第21页 |
| 1.7.4 WRKY转录因子在植物物质代谢中的作用 | 第21-22页 |
| 1.8 本实验的目的意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第23页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第23页 |
| 2.1.3 酶与各种生化试剂 | 第23页 |
| 2.1.4 PCR引物 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-41页 |
| 2.2.1 棉花的培养与处理 | 第24-25页 |
| 2.2.2 植物总RNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2.1 利用CTAB法提取棉花RNA | 第25-26页 |
| 2.2.2.2 利用Trizol Kit提取本生烟RAN | 第26页 |
| 2.2.3 cDNA第一链的合成 | 第26-27页 |
| 2.2.4 cDNA的纯化和加尾 | 第27页 |
| 2.2.4.1 cDNA的纯化 | 第27页 |
| 2.2.4.2 cDNA 5'末端加尾反应(用于5'RACE) | 第27页 |
| 2.2.5 GhWRKY39全长cDNA序列的获得 | 第27-28页 |
| 2.2.5.1 利用简并引物进行PCR扩增以获得中间片段 | 第27-28页 |
| 2.2.5.2 5'RACE和3'RACE分别获得5'端和3'端序列 | 第28页 |
| 2.2.5.3 cDNA全长序列的获得 | 第28页 |
| 2.2.6 获得启动子序列 | 第28-29页 |
| 2.2.7 回收目的片段 | 第29-30页 |
| 2.2.8 目的片段与克隆载体进行连接 | 第30页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第30-31页 |
| 2.2.9.1 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第30页 |
| 2.2.9.2 转化大肠杆菌感受态细胞 | 第30-31页 |
| 2.2.10 试剂盒法(微量法)提取大肠杆菌质粒DNA | 第31页 |
| 2.2.11 酶切鉴定重组质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.12 DNA序列测定 | 第32页 |
| 2.2.13 植物表达载体的构建与转化 | 第32-33页 |
| 2.2.13.1 制备农杆菌感受态细胞 | 第32页 |
| 2.2.13.2 构建植物表达载体与转化农杆菌感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.2.14 转基因植株的获得 | 第33-34页 |
| 2.2.14.1 转基因本生烟的获得 | 第33页 |
| 2.2.14.2 转基因拟南芥的获得 | 第33-34页 |
| 2.2.15 植物基因组DNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.15.1 棉花基因组DNA的提取与纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.15.2 小量法提取烟草和拟南芥基因组DNA | 第35页 |
| 2.2.16 实时荧光定量PCR | 第35-36页 |
| 2.2.16.1 采用定量PCR的方法检测GhWRKY39的拷贝数 | 第35-36页 |
| 2.2.16.2 采用定量PCR的方法分析GhWRKY39的表达特性 | 第36页 |
| 2.2.17 基因枪瞬时转化 | 第36-38页 |
| 2.2.17.1 目的基因融合GFP表达载体的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.17.2 基因枪微弹的准备 | 第37页 |
| 2.2.17.3 基因枪的转化 | 第37-38页 |
| 2.2.18 组织化学染色 | 第38-39页 |
| 2.2.18.1 DAB染色 | 第38页 |
| 2.2.18.2 NBT染色 | 第38-39页 |
| 2.2.18.3 GUS染色 | 第39页 |
| 2.2.19 转基因植株的抗病分析 | 第39-40页 |
| 2.2.19.1 病原菌培养基的配制 | 第39页 |
| 2.2.19.2 病原菌的培养 | 第39页 |
| 2.2.19.3 病原物接种实验 | 第39-40页 |
| 2.2.20 网络资源及数据库 | 第40页 |
| 2.2.21 生物学软件 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-64页 |
| 3.1 棉花GhWRKY39基因的分离及序列分析 | 第41-45页 |
| 3.1.1 GhWRKY39中间片段的分离 | 第41页 |
| 3.1.2 GhWRKY39 5'非编码区的分离 | 第41页 |
| 3.1.3 GhWRKY39 3'非编码区的分离 | 第41-42页 |
| 3.1.4 GhWRKY39全长cDNA的分离 | 第42页 |
| 3.1.5 GhWRKY39全长cDNA序列分析 | 第42-43页 |
| 3.1.6 GhWRKY39的氨基酸序列分析及其进化树分析 | 第43-45页 |
| 3.2 GhWRKY39基因组的分离及拷贝数分析 | 第45-47页 |
| 3.2.1 GhWRKY39基因组的分离 | 第45-46页 |
| 3.2.2 GhWRKY39的拷贝数分析 | 第46-47页 |
| 3.3 GhWRKY39的启动子分析 | 第47-49页 |
| 3.3.1 GhWRKY39启动子的分离及顺式作用元件的预测 | 第47页 |
| 3.3.2 GhWRKY39的启动子活性分析 | 第47-49页 |
| 3.4 GhWRKY39的表达特性分析 | 第49-51页 |
| 3.4.1 GhWRKY39在生物胁迫下的表达特性分析 | 第49-50页 |
| 3.4.2 GhWRKY39在非生物胁迫下的表达特性分析 | 第50-51页 |
| 3.5 GhWRKY39的亚细胞定位分析 | 第51-52页 |
| 3.6 GhWRKY39超表达植株的获得与鉴定 | 第52-54页 |
| 3.6.1 植物表达载体的构建 | 第52页 |
| 3.6.2 超表达GhWRKY39转基因本生烟的获得 | 第52-53页 |
| 3.6.3 超标达GhWRKY39转基因本生烟的鉴定 | 第53-54页 |
| 3.7 GhWRKY39超表达植株的抗病分析 | 第54-57页 |
| 3.7.1 细菌和真菌抗性分析 | 第54页 |
| 3.7.2 病原菌处理下H_2O_2含量的测定 | 第54-55页 |
| 3.7.3 抗性相关基因的表达模式分析 | 第55-57页 |
| 3.8 转基因植株对高盐胁迫的抗性分析 | 第57-60页 |
| 3.9 转基因植株的抗氧化分析 | 第60-64页 |
| 3.9.1 高盐胁迫下,转基因植株的ROS含量下降,抗氧化能力提高 | 第60-61页 |
| 3.9.2 抗氧化基因的表达模式分析 | 第61-62页 |
| 3.9.3 抗氧化酶活性的测定 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-68页 |
| 4.1 GhWRKY39属于Ⅱd WRKY家族成员 | 第64页 |
| 4.2 GhWRKY39的表达受多种环境胁迫及信号分子的诱导 | 第64-65页 |
| 4.3 GhWRKY39参与抗病信号途径 | 第65-66页 |
| 4.4 GhWRKY39参与ROS信号途径 | 第66页 |
| 4.5 超表达GhWRKY39提高植株对高盐胁迫的抗性 | 第66-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第77页 |
