| 摘要 | 第7-8页 |
| ABSTRACT | 第8页 |
| 第一章 布鲁菌病研究进展 | 第9-15页 |
| 1.1 布鲁菌的病原学特性 | 第9-10页 |
| 1.2 布鲁菌病流行现状 | 第10页 |
| 1.3 布鲁菌的检测方法 | 第10-11页 |
| 1.3.1 细菌学方法 | 第11页 |
| 1.3.2 免疫学方法 | 第11页 |
| 1.3.3 分子生物学方法 | 第11页 |
| 1.4 布鲁菌的疫苗 | 第11-12页 |
| 1.5 布鲁菌的外膜抗原 | 第12-15页 |
| 1.5.1 第 1 组外膜蛋白 | 第12-13页 |
| 1.5.2 第 2 组外膜蛋白 | 第13页 |
| 1.5.3 第 3 组外膜蛋白 | 第13-15页 |
| 第二章 布鲁菌 Omp19 基因的原核表达及其抗体的制备 | 第15-40页 |
| 2.1 试验材料及仪器设备 | 第15-17页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第15-16页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第16-17页 |
| 2.1.3 实验动物 | 第17页 |
| 2.1.4 细胞及载体 | 第17页 |
| 2.2 方法 | 第17-28页 |
| 2.2.1 布鲁菌 Omp19 基因的克隆 | 第17-20页 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 | 第17页 |
| 2.2.1.2 布鲁菌基因组的提取 | 第17-18页 |
| 2.2.1.3 PCR 扩增目的片段 | 第18页 |
| 2.2.1.4 PCR 产物的回收纯化 | 第18-19页 |
| 2.2.1.5 PCR 产物与 pMD18-T Simple 载体连接 | 第19页 |
| 2.2.1.6 重组质粒的提取 | 第19-20页 |
| 2.2.1.7 重组质粒的酶切鉴定 | 第20页 |
| 2.2.2 布鲁菌 Omp19 的原核表达 | 第20-23页 |
| 2.2.2.1 重组质粒与表达载体的双酶切 | 第20-21页 |
| 2.2.2.2 重组质粒与表达载体的胶回收 | 第21页 |
| 2.2.2.3 表达载体与目的片段的连接 | 第21-22页 |
| 2.2.2.4 重组表达载体的鉴定 | 第22页 |
| 2.2.2.5 pET32a-Omp19 重组载体的转化 | 第22页 |
| 2.2.2.6 融合蛋白的诱导表达 | 第22页 |
| 2.2.2.7 表达产物 SDS-PAGE 鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.3 布鲁菌 Omp19 的纯化 | 第23-24页 |
| 2.2.3.1 样品准备 | 第23-24页 |
| 2.2.3.2 层析纯化 | 第24页 |
| 2.2.4 动物免疫 | 第24-25页 |
| 2.2.4.1 小鼠免疫 | 第24页 |
| 2.2.4.2 间接 ELISA 法检测抗体效价 | 第24-25页 |
| 2.2.5 抗 His-Omp19 单克隆杂交瘤细胞株的建立 | 第25-27页 |
| 2.2.5.1 细胞融合剂的配制 | 第25页 |
| 2.2.5.2 SP2/0 骨髓瘤细胞的准备 | 第25-26页 |
| 2.2.5.3 饲养细胞的准备 | 第26页 |
| 2.2.5.4 小鼠免疫脾细胞的制备 | 第26页 |
| 2.2.5.5 细胞融合 | 第26-27页 |
| 2.2.6 单克隆细胞株的建立 | 第27-28页 |
| 2.2.6.1 阳性克隆的筛选 | 第27页 |
| 2.2.6.2 阳性单克隆的亚克隆筛选 | 第27-28页 |
| 2.3 结果 | 第28-37页 |
| 2.3.1 布鲁菌基因组提取 | 第28页 |
| 2.3.2 目的基因 PCR 结果 | 第28页 |
| 2.3.3 PCR 产物回收纯化 | 第28-29页 |
| 2.3.4 目的片段与 pMD18-T Simple 载体连接 | 第29-30页 |
| 2.3.5 目的基因产物测序 | 第30-31页 |
| 2.3.6 目的片段与 pET32a 连接 | 第31-32页 |
| 2.3.7 表达载体转化 BL21 感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.3.8 融合蛋白诱导表达 | 第33-34页 |
| 2.3.9 融合蛋白纯化 | 第34-35页 |
| 2.3.10 动物免疫 | 第35页 |
| 2.3.11 SP/20 骨髓瘤细胞的准备 | 第35页 |
| 2.3.12 饲养层细胞的准备 | 第35-36页 |
| 2.3.13 细胞融合结果 | 第36页 |
| 2.3.14 阳性克隆的筛选 | 第36-37页 |
| 2.4 讨论 | 第37-39页 |
| 2.4.1 目的基因的选择 | 第37页 |
| 2.4.2 引物的设计 | 第37页 |
| 2.4.3 目的基因的 PCR | 第37页 |
| 2.4.4 PCR 产物与 T 载体的连接 | 第37-38页 |
| 2.4.5 目的蛋白的诱导表达 | 第38页 |
| 2.4.6 蛋白纯化 | 第38页 |
| 2.4.7 SP2/0 骨髓瘤细胞的准备 | 第38页 |
| 2.4.8 饲养层细胞的准备 | 第38页 |
| 2.4.9 免疫脾细胞的制备 | 第38-39页 |
| 2.4.10 细胞融合 | 第39页 |
| 2.5 结论 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-43页 |
| 附录 | 第43-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 作者简介 | 第46页 |
