| 中文摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9页 |
| 1 前言 | 第10-20页 |
| 1.1 嗜热丝孢菌的应用 | 第10页 |
| 1.2 几丁质酶的研究 | 第10-14页 |
| 1.2.1 几丁质酶的结构与功能 | 第11页 |
| 1.2.2 几丁质酶的作用原理 | 第11-12页 |
| 1.2.3 几丁质酶基因在植物转化中的应用 | 第12-14页 |
| 1.3 信号肽 | 第14页 |
| 1.4 利用基因工程防治水稻纹枯病的应用 | 第14-15页 |
| 1.5 水稻遗传转化方法的发展历程 | 第15-17页 |
| 1.5.1 PEG(Polyethylene Glycol)介导法 | 第15-16页 |
| 1.5.2 电激法(Eletroporation) | 第16页 |
| 1.5.3 基因枪法(Particle bombardment,Particle gun) | 第16页 |
| 1.5.4 农杆菌介导法(Agrobacterium mediated) | 第16-17页 |
| 1.6 选题的目的意义、研究内容和技术路线 | 第17-20页 |
| 1.6.1 目的意义 | 第17-19页 |
| 1.6.2 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-38页 |
| 2.1. 材料 | 第20-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 酶和生化试剂 | 第20页 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 | 第20页 |
| 2.1.4 溶液与培养基的配制 | 第20-25页 |
| 2.1.4.1 溶液的配制 | 第20-24页 |
| 2.1.4.2 培养基的配制 | 第24-25页 |
| 2.2 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)Lan425基因的克隆 | 第25-30页 |
| 2.2.1 PCR引物设计 | 第25-26页 |
| 2.2.2 总RNA的提取(Trizol法) | 第26页 |
| 2.2.3 紫外检测RNA产率和纯度 | 第26页 |
| 2.2.4 反转录cDNA第一链的合成(TaKaRa) | 第26-27页 |
| 2.2.5 PCR扩增Lan425基因 | 第27页 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶纯化特异DNA片断 | 第27-28页 |
| 2.2.7 与载体连接 | 第28页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第28-29页 |
| 2.2.8.1 大肠杆菌DH5a感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.8.2 大肠杆菌DH5a感受态的转化 | 第29页 |
| 2.2.9 菌落PCR检测 | 第29页 |
| 2.2.10 序列测定 | 第29-30页 |
| 2.3 Lan425基因在水稻中的转化及抗性分析 | 第30-38页 |
| 2.3.1 水稻表达载体的构建 | 第30页 |
| 2.3.2 提取质粒 | 第30-31页 |
| 2.3.3 质粒DNA的双酶切鉴定 | 第31页 |
| 2.3.4 转化农杆菌(EHA105) | 第31-34页 |
| 2.3.4.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.3.4.2 DNA直接转化农杆菌 | 第32-33页 |
| 2.3.4.3 重组农杆菌鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.5 农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程 | 第34-35页 |
| 2.3.5.1 愈伤诱导 | 第34页 |
| 2.3.5.2 愈伤继代 | 第34页 |
| 2.3.5.3 预培养 | 第34页 |
| 2.3.5.4 农杆菌准备 | 第34页 |
| 2.3.5.5 农杆菌悬浮培养准备 | 第34页 |
| 2.3.5.6 农杆菌侵染(共培养 | 第34页 |
| 2.3.5.7 水洗和筛选 | 第34-35页 |
| 2.3.5.8 预分化与分化 | 第35页 |
| 2.3.5.9 生根 | 第35页 |
| 2.3.5.10 移栽 | 第35页 |
| 2.3.6 转基因水稻植株的分子生物学检测 | 第35-38页 |
| 2.3.6.1 水稻基因组的提取 | 第35-36页 |
| 2.3.6.2 转基因植株的PCR检测 | 第36页 |
| 2.3.6.3 RT-PCR检测 | 第36-37页 |
| 2.3.6.4 转Lan425基因水稻与非转基因水稻几丁质酶基因活性的测定 | 第37页 |
| 2.3.6.5 转基因水稻的抗病性检测 | 第37-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-52页 |
| 3.1 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)Lan425基因的克隆 | 第38-42页 |
| 3.1.1 疏绵状嗜热丝孢菌总RNA的提取 | 第38页 |
| 3.1.2 疏绵状嗜热丝孢菌Lan425基因的克隆 | 第38-39页 |
| 3.1.3 疏绵状嗜热丝孢菌几丁质酶基因的核苷酸和氨基酸序列分析 | 第39-41页 |
| 3.1.4 蛋白质的保守结构域分析 | 第41页 |
| 3.1.5 信号肽分析 | 第41-42页 |
| 3.2 疏绵状嗜热丝孢菌几丁质酶基因Lau425在水稻中的转化及抗病性分析 | 第42-52页 |
| 3.2.1 几丁质酶基因酶切位点的分析 | 第42-43页 |
| 3.2.2 水稻表达载体(pCAMBIA1300/Lan425)的构建 | 第43-45页 |
| 3.2.3 转化农杆菌 | 第45页 |
| 3.2.4 pCAMBIA1300/EHA105-Lan425介导转化水稻 | 第45-48页 |
| 3.2.4.1 愈伤组织的诱导与继代 | 第46页 |
| 3.2.4.2 共培养与抗性筛选 | 第46-47页 |
| 3.2.4.3 预分化与分化 | 第47-48页 |
| 3.2.5 转Lan425基因水稻的分子检测 | 第48-50页 |
| 3.2.5.1 PCR检测与测序 | 第48-49页 |
| 3.2.5.2 RT-PCR检测 | 第49-50页 |
| 3.2.6 转Lan425基因水稻与非转基因水稻几丁质酶基因活性的测定 | 第50页 |
| 3.2.7 转Lan425基因水稻的抗性分析 | 第50-51页 |
| 3.2.8 T_0代水稻种子与T_1代幼苗 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 4.1 几丁质酶基因的结构 | 第52页 |
| 4.2 几丁质酶基因转水稻研究 | 第52页 |
| 4.3 农杆菌介导的转基因水稻的研究 | 第52-53页 |
| 4.4 野生型与转几丁质酶基因水稻抗病性的比较 | 第53-54页 |
| 5 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
