| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 丙氨酸消旋酶生物学特点 | 第13-14页 |
| 1.2 不同菌种来源的丙氨酸消旋酶 | 第14-17页 |
| 1.2.1 含有两个不同的丙氨酸消旋酶 | 第15-16页 |
| 1.2.2 含单一丙氨酸消旋酶 | 第16-17页 |
| 1.3 丙氨酸消旋酶的结构解析 | 第17页 |
| 1.4 丙氨酸消旋酶的PLP依赖性 | 第17-18页 |
| 1.5 丙氨酸消旋酶的表达纯化方法及纯化效率 | 第18-19页 |
| 1.6 丙氨酸消旋酶活性的测定方法 | 第19-20页 |
| 1.6.1 D-氨基酸氧化反应法测定丙氨酸消旋酶的活性 | 第19-20页 |
| 1.6.2 测定酶动力学参数的方法测丙氨酸消旋酶活性 | 第20页 |
| 1.6.3 根据旋光值吸收变化测定消旋酶的活力 | 第20页 |
| 1.7 展望 | 第20-22页 |
| 第二章 专性嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶基因在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第22-42页 |
| 2.1 材料与方法 | 第22-32页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第22-26页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第26-32页 |
| 2.2 结果与分析 | 第32-40页 |
| 2.2.1 丙氨酸消旋酶基因克隆及载体构建 | 第32-34页 |
| 2.2.2 丙氨酸消旋酶基因序列及比对 | 第34-36页 |
| 2.2.3 丙氨酸消旋酶基因功能互补实验 | 第36页 |
| 2.2.4 丙氨酸消旋酶DadXOF4的原核诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.2.5 丙氨酸消旋酶蛋白纯化及分子量测定 | 第37-38页 |
| 2.2.6 辅酶PLP依赖性 | 第38-39页 |
| 2.2.7 测定酶蛋白动力学参数 | 第39-40页 |
| 2.3 小结 | 第40-42页 |
| 第三章 专性嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶基因突变位点选择、突变体的构建和表达纯化 | 第42-55页 |
| 3.1 材料和方法 | 第42-46页 |
| 3.1.1 工具酶和试剂 | 第42-43页 |
| 3.1.2 定点突变引物设计 | 第43页 |
| 3.1.3 重叠延伸法定点突变 | 第43-46页 |
| 3.1.4 蛋白的诱导表达和纯化 | 第46页 |
| 3.2 结果与分析 | 第46-54页 |
| 3.2.1 丙氨酸消旋酶突变位点的选择 | 第46-48页 |
| 3.2.2 含有突变位点的表达质粒的构建 | 第48-50页 |
| 3.2.3 突变体基因的测序及序列比对结果 | 第50-51页 |
| 3.2.4 突变体蛋白营养缺陷性互补实验 | 第51-52页 |
| 3.2.5 突变体酶蛋白纯化结果 | 第52-54页 |
| 3.3 小结 | 第54-55页 |
| 第四章 嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶野生型及突变体的酶学特性的比较研究 | 第55-63页 |
| 4.1 材料与方法 | 第55-57页 |
| 4.1.1 本研究所用材料与试剂 | 第55页 |
| 4.1.2 试验方法操作 | 第55-57页 |
| 4.2 实验结果与分析 | 第57-62页 |
| 4.2.1 丙氨酸消旋酶蛋白最适反应温度 | 第57-58页 |
| 4.2.2 丙氨酸消旋酶蛋白最适反应pH | 第58-59页 |
| 4.2.3 丙氨酸消旋酶底物特异性研究 | 第59-60页 |
| 4.2.4 丙氨酸消旋酶蛋白热稳定性结果 | 第60-61页 |
| 4.2.5 丙氨酸消旋酶蛋白pH稳定性结果 | 第61-62页 |
| 4.3 小结 | 第62-63页 |
| 第五章 饱和突变文库的构建与筛选 | 第63-69页 |
| 5.1 实验材料与方法 | 第63-67页 |
| 5.1.1 工具酶和试剂 | 第63页 |
| 5.1.2 试剂盒法全质粒饱和突变PCR | 第63-65页 |
| 5.1.3 大肠杆菌电转感受态的制备 | 第65页 |
| 5.1.4 饱和突变产物的电转化 | 第65-66页 |
| 5.1.5 饱和突变库的构建与筛选 | 第66页 |
| 5.1.6 阳性突变体的纯化 | 第66页 |
| 5.1.7 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度 | 第66页 |
| 5.1.8 野生型及突变体酶学性质的测定 | 第66-67页 |
| 5.2 实验结果与分析 | 第67-68页 |
| 5.2.1 饱和突变库的筛选与序列比对 | 第67页 |
| 5.2.2 突变体粗酶相对酶活力的比较 | 第67-68页 |
| 5.3 小结 | 第68-69页 |
| 讨论 | 第69-72页 |
| 结论 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-81页 |
| 附录 | 第81-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 | 第85页 |
