| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-25页 |
| 1.1 生物素连接酶BirA的研究概况 | 第12-16页 |
| 1.1.1 BirA酶的基因序列 | 第12-13页 |
| 1.1.2 BirA酶的结构和反应机制 | 第13-14页 |
| 1.1.3 BirA酶的应用 | 第14页 |
| 1.1.4 BirA酶的催化标签 | 第14-16页 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统研究现状 | 第16-20页 |
| 1.2.1 常用表达菌株及表达载体 | 第17-18页 |
| 1.2.2 基因转化及表达调控的机理 | 第18-19页 |
| 1.2.3 表达菌株的培养 | 第19-20页 |
| 1.3 毕赤酵母系统研究现状 | 第20-25页 |
| 1.3.1 常用表达菌株及表达载体 | 第21-23页 |
| 1.3.2 表达载体的整合方式 | 第23-24页 |
| 1.3.3 毕赤酵母表达系统 | 第24-25页 |
| 第二章 BirA酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第25-41页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料和仪器 | 第25-28页 |
| 2.2.1 菌株 | 第25-26页 |
| 2.2.2 质粒 | 第26页 |
| 2.2.3 培养基 | 第26页 |
| 2.2.4 试剂和酶 | 第26页 |
| 2.2.5 仪器和设备 | 第26-27页 |
| 2.2.6 实验主溶液的配制方法 | 第27-28页 |
| 2.3 方法 | 第28-37页 |
| 2.3.1 pET23a-BirA构建流程图 | 第28-32页 |
| 2.3.2 重组子转化感受态菌E.coli XL10-Gold | 第32-34页 |
| 2.3.3 IPTG诱导表达目的蛋白 | 第34页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE检测目的蛋白的表达 | 第34-35页 |
| 2.3.5 目的蛋白浓度测定 | 第35-37页 |
| 2.4 结果与分析 | 第37-41页 |
| 2.4.1 载体构建及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4.2 目的蛋白条带分析 | 第38-41页 |
| 第三章 BirA在毕赤酵母中的表达 | 第41-67页 |
| 3.1 引言 | 第41-42页 |
| 3.2 材料和仪器 | 第42-44页 |
| 3.2.1 菌株 | 第42页 |
| 3.2.2 质粒 | 第42页 |
| 3.2.3 培养基 | 第42-43页 |
| 3.2.4 主要用酶 | 第43页 |
| 3.2.5 仪器和设备 | 第43页 |
| 3.2.6 实验主要溶液的配制方法 | 第43-44页 |
| 3.3 方法 | 第44-51页 |
| 3.3.1 pHBM905A-BDM-BirA构建流程图 | 第44-45页 |
| 3.3.2 BirA酶表达载体的构建 | 第45-51页 |
| 3.4 毕赤酵母大规模发酵方法 | 第51-52页 |
| 3.4.1 预备发酵罐,三角瓶种子培养: | 第51页 |
| 3.4.2 甘油分批培养阶段 | 第51-52页 |
| 3.4.3 甲醇分批补料阶段 | 第52页 |
| 3.5 SDS-PAGE检测目的蛋白的表达 | 第52页 |
| 3.6 Western Blotting鉴定 | 第52-54页 |
| 3.6.1 半干转法western blot | 第52-53页 |
| 3.6.2 湿转法western blot | 第53-54页 |
| 3.7 TEV酶切NUSA-BirA | 第54页 |
| 3.8 目的蛋白NUSA-BirA的纯化 | 第54-55页 |
| 3.9 测定目的蛋白浓度 | 第55页 |
| 3.10 生物素连接酶BirA的活性验证 | 第55-56页 |
| 3.10.1 SDS-PAGE胶验证 | 第55-56页 |
| 3.10.2 western blot验证 | 第56页 |
| 3.10.3 sfGFP-streptavidin验证 | 第56页 |
| 3.11 结果与分析 | 第56-67页 |
| 3.11.1 原核表达载体的构建及鉴定 | 第56-59页 |
| 3.11.2 BDM-BirA质粒转酵母后以酵母总DNA为模板做PCR挑选酵母重组子 | 第59页 |
| 3.11.3 筛选NUSA-BirA重组子质粒 | 第59-61页 |
| 3.11.4 酵母总DNA为模板做PCR鉴定重组子 | 第61页 |
| 3.11.5 BirA在KM71中的摇瓶表达 | 第61-62页 |
| 3.11.6 NUSA-BirA融合蛋白在KM71发酵罐中的表达 | 第62-63页 |
| 3.11.7 生物素连接酶BirA的活性验证 | 第63-67页 |
| 第四章 结果与讨论 | 第67-69页 |
| 4.1 结果 | 第67-68页 |
| 4.2 讨论 | 第68-69页 |
| 第五章 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
