| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 前言 | 第15-20页 |
| 1 猪附红细胞体病简介 | 第15-16页 |
| 1.1 猪附红细胞体病研究概述 | 第15页 |
| 1.2 猪附红细胞体蛋白研究现状 | 第15-16页 |
| 1.3 猪附红细胞体α-烯醇化酶基因 | 第16页 |
| 2 酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)研究进展 | 第16-18页 |
| 2.1 酵母双杂交原理 | 第17-18页 |
| 2.2 酵母双杂交应用 | 第18页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第18-20页 |
| 材料与方法 | 第20-36页 |
| 1 材料 | 第20-23页 |
| 1.1 实验菌株 | 第20页 |
| 1.2 主要试剂 | 第20页 |
| 1.3 主要仪器 | 第20-21页 |
| 1.4 各种试剂配制 | 第21-23页 |
| 1.4.1 构建文库主要试剂 | 第21-22页 |
| 1.4.2 诱饵载体构建、杂交筛选及共转化验证主要试剂 | 第22-23页 |
| 1.4.3 其他试剂 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23-36页 |
| 2.1 猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库的构建 | 第23-28页 |
| 2.1.1 猪外周血单个核细胞(PBMC)的分离 | 第23-24页 |
| 2.1.2 猪外周血单个核细胞总RNA的提取 | 第24页 |
| 2.1.3 猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库的构建 | 第24-27页 |
| 2.1.3.1 cDNA第一条链的扩增 | 第24-25页 |
| 2.1.3.2 链cDNA LD-PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.1.3.3 链cDNA的纯化 | 第26页 |
| 2.1.3.4 猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及收集 | 第26-27页 |
| 2.1.4 酵母双杂交cDNA文库的质量鉴定 | 第27-28页 |
| 2.1.4.1 酵母双杂交cDNA文库容量测定 | 第27-28页 |
| 2.1.4.2 插入片段长度检测 | 第28页 |
| 2.2 α-烯醇化酶诱饵载体pGBKT7-enolase的构建 | 第28-32页 |
| 2.2.1 构建pGBKT7-enolase诱饵载体 | 第28-31页 |
| 2.2.1.1 引物设计和合成 | 第28-29页 |
| 2.2.1.2 α-烯醇化酶基因全长获取 | 第29-30页 |
| 2.2.1.3 α-烯醇化酶基因的克隆 | 第30页 |
| 2.2.1.4 pGBKT7-enolase诱饵载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.2 酵母菌株Y2H感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 2.2.3 转化pGBKT7-enolase质粒到酵母Y2H感受态细胞 | 第31-32页 |
| 2.2.4 pGBKT7-enolase诱饵载体自激活检测 | 第32页 |
| 2.2.5 pGBKT7-enolase诱饵载体毒性作用检测 | 第32页 |
| 2.3 酵母双杂交筛选与α-烯醇化酶蛋白有相互作用的宿主蛋白 | 第32-34页 |
| 2.3.1 转化了pGBKT7-enolase诱饵质粒的Y2H酵母菌与转化了PBMC cDNA的Y187酵母菌进行杂交筛选 | 第32-33页 |
| 2.3.2 PCR鉴定蓝斑克隆中插入的cDNA片段 | 第33-34页 |
| 2.3.3 蓝斑克隆的测序分析 | 第34页 |
| 2.4 诱饵蛋白与互作蛋白的共转化验证 | 第34-36页 |
| 2.4.1 酵母质粒的提取 | 第34-35页 |
| 2.4.2 酵母质粒纯化 | 第35页 |
| 2.4.3 共转化验证 | 第35-36页 |
| 结果 | 第36-48页 |
| 1 猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库的构建 | 第36-38页 |
| 1.1 总RNA的提取 | 第36页 |
| 1.2 双链cDNA的LD-PCR扩增及纯化 | 第36-37页 |
| 1.3 cDNA文库的鉴定 | 第37-38页 |
| 2 诱饵载体pGBKT7-enolase的构建 | 第38-42页 |
| 2.1 α-烯醇化酶基因全长的获取、克隆及序列分析 | 第38-40页 |
| 2.2 重组质粒pGBKT7-enolase的构建及转化酵母感受态细胞Y2H | 第40-41页 |
| 2.3 pGBKT7-enolase诱饵载体自激活检测 | 第41-42页 |
| 2.4 pGBKT7-enolase诱饵载体毒性作用检测 | 第42页 |
| 3 pGBKT7-enolase诱饵载体和PBMC表达文库的杂交筛选 | 第42-45页 |
| 3.1 筛选的克隆 | 第42-43页 |
| 3.2 筛选的蓝色阳性克隆 | 第43页 |
| 3.3 PCR扩增蓝斑克隆中插入的cDNA片段 | 第43-44页 |
| 3.4 测序结果分析 | 第44-45页 |
| 4 诱饵蛋白pGBKT7-enolase与互作蛋白的共转化验证 | 第45-48页 |
| 讨论 | 第48-51页 |
| 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 附录A (作者简介) | 第59-60页 |
| 附录B (在研期间发表的论文) | 第60页 |
