| 中文摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3页 |
| 中文文摘 | 第4-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 绪论 | 第12-30页 |
| 1.1 丝状真菌里氏木霉表达系统研究概况 | 第12-15页 |
| 1.1.1 里氏木霉表达系统特点 | 第12页 |
| 1.1.2 里氏木霉表达重组蛋白的研究现状 | 第12页 |
| 1.1.3 里氏木霉中表达重组蛋白的影响因素 | 第12-13页 |
| 1.1.4 里氏木霉遗传改造提高重组蛋白表达常用的策略 | 第13-15页 |
| 1.2 丝状真菌里氏木霉的纤维素酶和半纤维素酶 | 第15-21页 |
| 1.2.1 里氏木霉的纤维素酶 | 第15-17页 |
| 1.2.2 里氏木霉的半纤维素酶 | 第17-18页 |
| 1.2.3 里氏木霉纤维素酶基因的调控和诱导 | 第18-19页 |
| 1.2.4 里氏木霉中与纤维素酶表达相关的转录调控因子 | 第19-21页 |
| 1.3 丝状真菌里氏木霉的遗传操作体系 | 第21-24页 |
| 1.3.1 里氏木霉转化方法的研究 | 第22-23页 |
| 1.3.2 里氏木霉转化中常用的筛选标记 | 第23页 |
| 1.3.3 里氏木霉基因定点打靶或同源重组的技术研究概况 | 第23-24页 |
| 1.4 β-甘露聚糖酶的研究概况 | 第24-27页 |
| 1.4.1 β-甘露聚糖酶的定义及分布 | 第24-25页 |
| 1.4.2 β-甘露聚糖酶的分子生物学进展 | 第25页 |
| 1.4.3 里氏木霉来源的β-甘露聚糖酶 | 第25-26页 |
| 1.4.4 常用的甘露聚糖酶酶活测定方法 | 第26页 |
| 1.4.5 β-甘露聚糖酶的应用 | 第26-27页 |
| 1.5 本研究的目的意义与主要内容 | 第27-30页 |
| 第一章 里氏木霉双基因同步定点整合体系的构建 | 第30-46页 |
| 第一节 材料和方法 | 第30-38页 |
| 1.1 材料 | 第30-33页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第30页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第30页 |
| 1.1.3 实验材料及试剂盒 | 第30页 |
| 1.1.4 主要试剂及配制 | 第30-32页 |
| 1.1.5 培养基 | 第32页 |
| 1.1.6 引物 | 第32-33页 |
| 1.2 实验方法 | 第33-38页 |
| 1.2.1 里氏木霉菌株的培养 | 第33页 |
| 1.2.2 质粒的提取 | 第33页 |
| 1.2.3 里氏木霉基因组DNA的提取 | 第33页 |
| 1.2.4 man5A基因重组表达载体的构建及重组表达组件的获得 | 第33-35页 |
| 1.2.5 cbh2基因敲除载体的构建及敲除组件的获得 | 第35-36页 |
| 1.2.6 里氏木霉菌株原生质体的制备 | 第36-37页 |
| 1.2.7 里氏木霉原生质体的转化 | 第37页 |
| 1.2.8 里氏木霉转化子的筛选 | 第37-38页 |
| 第二节 结果与分析 | 第38-44页 |
| 2.1 里氏木霉甘露聚糖酶基因man5A重组表达载体的构建 | 第38-40页 |
| 2.2 里氏木霉纤维二糖水解酶基因Ⅱ(cbh2)敲除载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.3 里氏木霉Tu6△Ku70菌株原生质体的制备及转化 | 第41页 |
| 2.4 转化子的筛选及分子鉴定 | 第41-44页 |
| 第三节 小结与讨论 | 第44-46页 |
| 第二章 里氏木霉主要纤维二糖水解酶的缺失对甘露聚糖酶表达的影响 | 第46-64页 |
| 第一节 材料与方法 | 第46-55页 |
| 1.1 材料 | 第46-48页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第46页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第46页 |
| 1.1.3 实验材料及试剂盒 | 第46页 |
| 1.1.4 主要试剂及配置 | 第46-47页 |
| 1.1.5 培养基 | 第47-48页 |
| 1.2 实验方法 | 第48-55页 |
| 1.2.1 里氏木霉cbh1基因单敲除重组表达载体的构建 | 第48页 |
| 1.2.2 Tu6△Ku70原生质体的制备 | 第48页 |
| 1.2.3 Tu6△Ku70原生质体的转化 | 第48页 |
| 1.2.4 转化子的筛选及分子鉴定 | 第48-49页 |
| 1.2.5 里氏木霉菌株的培养及诱导表达 | 第49页 |
| 1.2.6 甘露聚糖酶酶活的测定 | 第49-50页 |
| 1.2.7 纤维素酶酶活的测定 | 第50-52页 |
| 1.2.8 Bradford法测定外分泌蛋白浓度 | 第52页 |
| 1.2.9 SDS-Page检测胞外蛋白表达情况 | 第52页 |
| 1.2.10 里氏木霉总RNA的提取 | 第52-53页 |
| 1.2.11 mRNA水平的表达差异研究 | 第53-55页 |
| 第二节 结果与分析 | 第55-62页 |
| 2.1 里氏木霉cbhl基因单敲除重组表达菌株TrMan11的获得 | 第55页 |
| 2.2 阳性转化子的分子鉴定 | 第55-56页 |
| 2.3 出发菌株与重组菌株TrMan11、TrMan12的发酵诱导培养 | 第56页 |
| 2.4 出发菌株与重组菌株TrMan11、TrMan12中基因拷贝数鉴定 | 第56-57页 |
| 2.5 甘露聚糖酶酶活的测定 | 第57-58页 |
| 2.6 纤维素酶酶活的测定 | 第58-59页 |
| 2.7 外分泌蛋白含量的测定 | 第59-60页 |
| 2.8 SDS-PAGE电泳检测man5A基因的表达 | 第60-61页 |
| 2.9 出发菌株与重组菌株中man5A基因的mRNA水平分析 | 第61-62页 |
| 第三节 小结与讨论 | 第62-64页 |
| 第三章 转录抑制因子Cre1的敲除对甘露聚糖酶表达的影响 | 第64-78页 |
| 第一节 材料与方法 | 第64-68页 |
| 1.1 材料 | 第64-65页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第64页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第64页 |
| 1.1.3 实验材料及试剂 | 第64页 |
| 1.1.4 主要试剂及配置 | 第64页 |
| 1.1.5 引物 | 第64-65页 |
| 1.2 实验方法 | 第65-68页 |
| 1.2.1 TrMan12菌株中pyr4筛选标记的去除 | 第65-66页 |
| 1.2.2 Cre1敲除载体的构建 | 第66-67页 |
| 1.2.3 里氏木霉菌株TrMan12△pyr4原生质体的制备 | 第67页 |
| 1.2.4 里氏木霉菌株TrManl2△pyr4原生质体的转化 | 第67页 |
| 1.2.5 阳性转化子筛选及分子鉴定 | 第67-68页 |
| 1.2.6 里氏木霉菌株的培养及诱导发酵 | 第68页 |
| 1.2.7 胞外蛋白浓度的测定 | 第68页 |
| 1.2.8 SDS-PAGE检测蛋白表达情况 | 第68页 |
| 1.2.9 mRNA水平的检测 | 第68页 |
| 1.2.10 Cre1敲除组件插入位点拷贝数的鉴定 | 第68页 |
| 第二节 结果与分析 | 第68-75页 |
| 2.1 确定5-FOA最小抑制剂量 | 第68页 |
| 2.2 TrMan12△pyr4菌株的筛选及分子鉴定 | 第68-70页 |
| 2.3 Cre1敲除载体的构建 | 第70-71页 |
| 2.4 阳性转化子筛选及分子鉴定 | 第71-72页 |
| 2.5 出发菌株与重组菌株TrMan12,TrMan13胞外蛋白含量的检测 | 第72-73页 |
| 2.6 SDS-PAGE检测出发菌株与重组菌株TrMan12,TrMan13蛋白表达情况 | 第73-74页 |
| 2.7 重组菌株TrMan13中cre1基因敲除组件插入基因组拷贝数的鉴定 | 第74-75页 |
| 2.8 重组菌株TrMan12,TrMan13中man5A基因在mRNA水平的表达情况 | 第75页 |
| 第三节 小结与讨论 | 第75-78页 |
| 第四章 结论 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第88-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 个人简历 | 第92-93页 |
