纤溶酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 前言 | 第10-18页 |
| ·血栓性疾病及危害 | 第10页 |
| ·血栓疾病的治疗及溶栓药物的发展 | 第10-11页 |
| ·血栓性疾病的治疗方法 | 第10页 |
| ·溶血栓药物的发展 | 第10-11页 |
| ·纤溶酶类溶栓剂的来源及研究 | 第11-13页 |
| ·动物来源的纤溶酶 | 第11-12页 |
| ·植物来源的纤溶酶 | 第12页 |
| ·微生物来源的纤溶酶 | 第12-13页 |
| ·纤溶酶基因克隆表达的研究 | 第13页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第13-15页 |
| ·表达载体 | 第14页 |
| ·各种类型表达系统的构成及特点 | 第14-15页 |
| ·目的蛋白表达的形式和在细胞中的位置 | 第15页 |
| ·大肠杆菌表达系统研究的新进展 | 第15页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究 | 第15-18页 |
| ·表达菌株 | 第15-16页 |
| ·表达载体 | 第16-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-32页 |
| ·试验材料 | 第18-21页 |
| ·菌株与质粒 | 第18页 |
| ·仪器设备 | 第18页 |
| ·主要培养基及试剂 | 第18-21页 |
| ·大肠杆菌表达方法 | 第21-29页 |
| ·假蕈状芽孢杆菌基因组DNA 的提取 | 第21-22页 |
| ·DNA 的纯度检测 | 第22页 |
| ·引物设计与合成 | 第22页 |
| ·成熟肽基因的扩增 | 第22页 |
| ·质粒的提取 | 第22-23页 |
| ·PCR 产物回收 | 第23页 |
| ·载体与PCR 产物的酶切 | 第23-24页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第24页 |
| ·载体与目的片段的连接 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第25页 |
| ·转化大肠杆菌感受态细胞 | 第25页 |
| ·阳性重组克隆的筛选 | 第25页 |
| ·质粒 DNA 的酶切验证 | 第25-26页 |
| ·序列分析 | 第26页 |
| ·重组菌在大肠杆菌中的诱导表达 | 第26页 |
| ·镍柱亲和层析 | 第26-27页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第27-28页 |
| ·表达蛋白活性的检测 | 第28-29页 |
| ·毕赤酵母表达方法 | 第29-32页 |
| ·引物设计与合成 | 第29页 |
| ·目的片段的扩增 | 第29页 |
| ·重组质粒pPIC9K-G 的构建 | 第29页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第29页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 | 第29-30页 |
| ·甲醇利用表型的确定 | 第30页 |
| ·重组酵母的PCR 验证 | 第30页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第30页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中的表达 | 第30-31页 |
| ·TCA 浓缩步骤 | 第31页 |
| ·镍柱亲和层析及活性检测 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-44页 |
| ·大肠杆菌表达结果 | 第32-36页 |
| ·假蕈状芽孢杆菌DNA 的提取及检测 | 第32页 |
| ·引物设计与合成 | 第32-33页 |
| ·纤溶酶BpFE 成熟肽基因扩增 | 第33页 |
| ·重组质粒pET28a-G 的双酶切检测 | 第33-34页 |
| ·重组质粒pET28a-G 的测序分析 | 第34页 |
| ·重组菌的诱导表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第34-35页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| ·融合蛋白的活性检测 | 第36页 |
| ·毕赤酵母表达结果 | 第36-41页 |
| ·引物设计与合成 | 第36页 |
| ·纤溶酶基因BpFE 的扩增 | 第36-37页 |
| ·重组质粒pPIC9K-G 的双酶切检测 | 第37-38页 |
| ·重组质粒pPIC9K-G 的测序结果 | 第38页 |
| ·重组酵母甲醇利用表型的确定 | 第38-39页 |
| ·重组毕赤酵母的PCR 鉴定 | 第39页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第39-40页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第40页 |
| ·镍柱亲和层析后SDS-PAGE 检测 | 第40-41页 |
| ·纯化后产物的活性检测 | 第41页 |
| ·讨论 | 第41-44页 |
| 4 小结与展望 | 第44-45页 |
| ·本论文的主要结论 | 第44页 |
| ·展望 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-49页 |
| 在读期间发表论文 | 第49-50页 |
| 作者简历 | 第50-51页 |
| 致谢 | 第51-52页 |
