| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 脯氨酰内肽酶的概述 | 第11-14页 |
| 1.1.1 脯氨酸 | 第11页 |
| 1.1.2 脯氨酰内肽酶的理化性质 | 第11-12页 |
| 1.1.3 脯氨酰内肽酶的晶体结构 | 第12-13页 |
| 1.1.4 脯氨酰内肽酶的催化机制 | 第13-14页 |
| 1.2 脯氨酰内肽酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.2.1 脯氨酰内肽酶在医学领域中的应用 | 第14页 |
| 1.2.2 脯氨酰内肽酶在多肽工业中的应用 | 第14页 |
| 1.2.3 脯氨酰内肽酶在食品工业中的应用 | 第14-15页 |
| 1.3 获得脯氨酰内肽酶的途径 | 第15-17页 |
| 1.3.1 通过微生物筛选产PEP菌 | 第16页 |
| 1.3.2 通过基因工程菌构建产PEP菌 | 第16-17页 |
| 1.3.3 通过纯化及浓缩制备PEP | 第17页 |
| 1.4 毕赤酵母作为表达体系的优点 | 第17-18页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达宿主菌 | 第17页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达载体 | 第17-18页 |
| 1.4.3 异源蛋白在毕赤酵母中表达 | 第18页 |
| 1.5 脯氨酰内肽酶的改造 | 第18页 |
| 1.6 本论文主要研究内容 | 第18-21页 |
| 1.6.1 脯氨酰内肽酶研究仍存在的问题 | 第18-19页 |
| 1.6.2 本论文的科学意义 | 第19页 |
| 1.6.3 本论文的研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 食品级脯氨酰内肽酶生产菌的筛选 | 第21-32页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 材料与方法 | 第21-25页 |
| 2.2.1 样品 | 第21页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第21页 |
| 2.2.3 培养基及试剂 | 第21-22页 |
| 2.2.4 产脯氨酰内肽酶菌株的筛选 | 第22页 |
| 2.2.5 酶活的测定 | 第22-23页 |
| 2.2.6 产脯氨酰内肽酶菌株的鉴定 | 第23页 |
| 2.2.7 脯氨酰内肽酶的纯化 | 第23页 |
| 2.2.8 脯氨酰内肽酶的酶学性质 | 第23-25页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第25-31页 |
| 2.3.1 食品级脯氨酰内肽酶生产菌的筛选 | 第25页 |
| 2.3.2 产酶菌株的鉴定 | 第25-27页 |
| 2.3.3 脯氨酰内肽酶分离纯化结果 | 第27页 |
| 2.3.4 脯氨酰内肽酶酶学性质 | 第27-30页 |
| 2.3.5 脯氨酰内肽酶水解酪蛋白产物的分析 | 第30-31页 |
| 2.4 本章小结 | 第31-32页 |
| 第三章 黑曲霉脯氨酰内肽酶基因克隆、异源表达及酶学性质研究 | 第32-46页 |
| 3.1 前言 | 第32页 |
| 3.2 材料和方法 | 第32-35页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第32页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第32页 |
| 3.2.3 培养基及溶液 | 第32-33页 |
| 3.2.4 主要试剂 | 第33页 |
| 3.2.5 RT-PCR扩增黑曲霉脯氨酰内肽酶基因及TA克隆 | 第33页 |
| 3.2.6 重组质粒的筛选 | 第33页 |
| 3.2.7 黑曲霉脯氨酰内肽酶结构的同源建模 | 第33页 |
| 3.2.8 重组菌的构建及发酵表达 | 第33-34页 |
| 3.2.9 重组黑曲霉脯氨酰内肽酶的纯化 | 第34页 |
| 3.2.10 重组黑曲霉脯氨酰内肽酶酶学性质 | 第34页 |
| 3.2.11 光谱法分析重组酶的结构变化 | 第34页 |
| 3.2.12 重组酶底物特异性及作用方式 | 第34-35页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第35-44页 |
| 3.3.1 黑曲霉脯氨酰内肽酶的克隆 | 第35页 |
| 3.3.2 黑曲霉脯氨酰内肽酶同源建模 | 第35-37页 |
| 3.3.3 黑曲霉脯氨酰内肽酶表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 3.3.4 黑曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中表达 | 第38页 |
| 3.3.5 重组黑曲霉脯氨酰内肽酶的纯化 | 第38-39页 |
| 3.3.6 重组酶酶学性质及构象变化分析 | 第39-43页 |
| 3.3.7 重组酶底物特异性及作用方式研究 | 第43-44页 |
| 3.4 本章小结 | 第44-46页 |
| 第四章 米曲霉脯氨酰内肽酶基因挖掘、序列分析及异源表达研究 | 第46-55页 |
| 4.1 前言 | 第46页 |
| 4.2 材料和方法 | 第46-48页 |
| 4.2.1 菌种和质粒 | 第46页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第46页 |
| 4.2.3 实验试剂 | 第46-47页 |
| 4.2.4 试剂配制 | 第47页 |
| 4.2.5 米曲霉脯氨酰内肽酶基因挖掘 | 第47页 |
| 4.2.6 重组质粒的筛选 | 第47页 |
| 4.2.7 米曲霉脯氨酰内肽酶结构的同源建模 | 第47页 |
| 4.2.8 重组米曲霉脯氨酰内肽酶表达体系的构建 | 第47页 |
| 4.2.9 重组菌的发酵表达及纯化 | 第47-48页 |
| 4.2.10 重组米曲霉脯氨酰内肽酶的酶学性质 | 第48页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第48-53页 |
| 4.3.1 反转录及PCR扩增 | 第48页 |
| 4.3.2 米曲霉脯氨酰内肽酶基因序列分析 | 第48-49页 |
| 4.3.3 米曲霉脯氨酰内肽酶结构分析及建模 | 第49-50页 |
| 4.3.4 米曲霉脯氨酰内肽酶表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 4.3.5 米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中表达 | 第51-52页 |
| 4.3.6 重组米曲霉脯氨酰内肽酶的酶学性质 | 第52-53页 |
| 4.4 本章小结 | 第53-55页 |
| 第五章 定点突变技术提高米曲霉脯氨酰内肽酶催化活性的研究 | 第55-67页 |
| 5.1 前言 | 第55页 |
| 5.2 材料和方法 | 第55-58页 |
| 5.2.1 菌种和质粒 | 第55页 |
| 5.2.2 主要仪器 | 第55页 |
| 5.2.3 主要培养基与试剂 | 第55-56页 |
| 5.2.4 模板质粒的提取及添加组氨酸标签的构建 | 第56页 |
| 5.2.5 一步法质粒PCR快速定点突变构建突变体 | 第56页 |
| 5.2.6 突变体的诱导表达 | 第56-57页 |
| 5.2.7 突变体的纯化 | 第57页 |
| 5.2.8 突变体的酶学性质 | 第57页 |
| 5.2.9 突变体AO-PEP基因mRNA转录水平的研究 | 第57-58页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第58-66页 |
| 5.3.1 突变位点的选择 | 第58-60页 |
| 5.3.2 AO-PEP突变体构建、重组表达与纯化 | 第60-62页 |
| 5.3.3 突变体的酶学性质 | 第62-64页 |
| 5.3.4 突变体AO-PEP mRNA转录水平的研究 | 第64-66页 |
| 5.4 本章小结 | 第66-67页 |
| 第六章 重组脯氨酰内肽酶改善啤酒非生物稳定性特性的研究 | 第67-83页 |
| 6.1 前言 | 第67页 |
| 6.2 材料和方法 | 第67-68页 |
| 6.2.1 菌种 | 第67页 |
| 6.2.2 主要仪器和试剂 | 第67页 |
| 6.2.3 培养基 | 第67页 |
| 6.2.4 培养方法 | 第67页 |
| 6.2.5 重组脯氨酰内肽酶保存稳定性的研究 | 第67-68页 |
| 6.2.6 光谱学分析重组脯氨酰内肽酶的结构变化 | 第68页 |
| 6.2.7 重组脯氨酰内肽酶热失活动力学研究 | 第68页 |
| 6.2.8 重组脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的评定 | 第68页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第68-82页 |
| 6.3.1 7L发酵罐发酵生产重组脯氨酰内肽酶 | 第68-69页 |
| 6.3.2 重组黑曲霉脯氨酰内肽酶保存稳定性的研究 | 第69-77页 |
| 6.3.3 重组脯氨酰内肽酶热失活动力学的研究 | 第77-79页 |
| 6.3.4 重组脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的评定 | 第79-82页 |
| 6.4 本章小结 | 第82-83页 |
| 主要结论 | 第83-84页 |
| 研究展望 | 第84-85页 |
| 论文主要创新点 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-95页 |
| 附录：表 | 第95-97页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文及专利 | 第97页 |
