| 摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 引言 | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-20页 |
| 1.1 Defensins概述 | 第10页 |
| 1.2 Defensins的分类 | 第10-13页 |
| 1.2.1 α-defensin | 第10-11页 |
| 1.2.2 β-defensin | 第11页 |
| 1.2.3 θ-defensin | 第11-12页 |
| 1.2.4 昆虫defensin | 第12页 |
| 1.2.5 植物defensin | 第12-13页 |
| 1.3 β-defensin的分子结构特征 | 第13-14页 |
| 1.3.1 β-defensin的初级结构 | 第13页 |
| 1.3.2 β-defensin的三级结构 | 第13-14页 |
| 1.4 β-defensin的生物学功能 | 第14-15页 |
| 1.4.1 β-defensin的抗微生物活性 | 第14页 |
| 1.4.2 β-defensin的免疫调节活性 | 第14页 |
| 1.4.3 β-defensin的其它生物学活性 | 第14-15页 |
| 1.5 β-defensin的杀菌机制 | 第15-16页 |
| 1.5.1 β-defensin与病原菌细胞膜的相互作用 | 第15页 |
| 1.5.2 β-defensin与病原菌内部靶位点的相互作用 | 第15-16页 |
| 1.6 爬行纲 β-defensin的研究现状 | 第16页 |
| 1.7 β-defensin表达系统研究现状 | 第16-19页 |
| 1.7.1 毕赤酵母表达系统 | 第17-18页 |
| 1.7.2 毕赤酵母表达系统宿主菌 | 第18页 |
| 1.7.3 表达载体 | 第18-19页 |
| 1.8 研究意义 | 第19-20页 |
| 2 目的基因的获取及生物信息学分析 | 第20-31页 |
| 2.1 引言 | 第20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-22页 |
| 2.2.1 NCBI数据库定向发掘爬行纲 β-defensins | 第20-21页 |
| 2.2.2 Ps-BD1~26 的理化性质、结构分析 | 第21页 |
| 2.2.3 系统发育树构建 | 第21页 |
| 2.2.4 Ps-BD1~26 从头建模 | 第21-22页 |
| 2.3 研究结果与讨论 | 第22-30页 |
| 2.3.1 NCBI数据库定向发掘爬行纲 β-defensins | 第22页 |
| 2.3.2 Ps-BDs的理化特性分析 | 第22-27页 |
| 2.3.3 爬行纲 β-defensins的进化关系分析 | 第27-28页 |
| 2.3.4 Ps-BDs结构预测和模拟 | 第28-30页 |
| 2.4 本章小结 | 第30-31页 |
| 3 β-defensins组织表达特异性分析 | 第31-36页 |
| 3.1 引言 | 第31页 |
| 3.2 仪器与试剂 | 第31-32页 |
| 3.2.1 实验动物 | 第31页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第31页 |
| 3.2.3 实验耗材及仪器 | 第31-32页 |
| 3.3 实验方法 | 第32-34页 |
| 3.3.1 引物的设计和合成 | 第32页 |
| 3.3.2 提取中华鳖各组织RNA | 第32页 |
| 3.3.3 cDNA文库的构建 | 第32-33页 |
| 3.3.4 半定量RT-PCR检测Ps-BDs的组织表达图谱 | 第33-34页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第34-35页 |
| 3.4.1 引物的设计和合成 | 第34页 |
| 3.4.2 Ps-BDs组织表达图谱分析 | 第34-35页 |
| 3.5 本章小结 | 第35-36页 |
| 4 真核表达载体的构建 | 第36-44页 |
| 4.1 引言 | 第36页 |
| 4.2 实验材料与试剂 | 第36-37页 |
| 4.2.1 实验菌株 | 第36页 |
| 4.2.2 材料与试剂 | 第36-37页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第37页 |
| 4.2.4 主要试剂配制方法 | 第37页 |
| 4.3 实验方法 | 第37-41页 |
| 4.3.1 Ps-BD2成熟肽基因的优化合成 | 第37页 |
| 4.3.2 pUCK-Ps-BD2与pPIC9K的双酶切 | 第37-38页 |
| 4.3.3 酶切产物的回收 | 第38页 |
| 4.3.4 PS-BD2与pPIC9K质粒的连接 | 第38-39页 |
| 4.3.5 DH5α 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39页 |
| 4.3.6 重组质粒的热击转化 | 第39页 |
| 4.3.7 阳性重组质粒DNA的提取 | 第39-40页 |
| 4.3.8 双酶切鉴定 | 第40页 |
| 4.3.9 阳性重组质粒的测序与分析 | 第40-41页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第41-43页 |
| 4.4.1 优化后PS-BD2基因序列 | 第41-42页 |
| 4.4.2 pPIC9K-Ps-BD2表达载体的构建及鉴定 | 第42-43页 |
| 4.5 本章小结 | 第43-44页 |
| 5 Ps-BD2在毕赤酵母中的表达及检测 | 第44-53页 |
| 5.1 前言 | 第44页 |
| 5.2 实验材料与试剂 | 第44-45页 |
| 5.2.1 实验菌株 | 第44页 |
| 5.2.2 材料与试剂 | 第44-45页 |
| 5.2.3 实验仪器 | 第45页 |
| 5.2.4 主要试剂及配制方法 | 第45页 |
| 5.3 实验方法 | 第45-48页 |
| 5.3.1 pPIC9K-PS-BD2质粒的线性化及质粒的纯化 | 第45页 |
| 5.3.2 毕赤酵母感受态的制备及转化 | 第45-47页 |
| 5.3.3 高拷贝阳性转化子的筛选及PCR鉴定 | 第47-48页 |
| 5.4 重组酵母转化子的诱导表达 | 第48页 |
| 5.5 酵母表达上清液的Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳检测 | 第48-49页 |
| 5.6 凝胶的制备 | 第49页 |
| 5.7 Tricine-SDS-PAGE电泳 | 第49页 |
| 5.8 电泳后凝胶处理 | 第49页 |
| 5.9 Ps-BD2的免疫印迹分析 | 第49-50页 |
| 5.10 实验结果与讨论 | 第50-51页 |
| 5.10.1 阳性转化子的PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 5.10.2 Ps-BD2 Tricine-SDS-PAGE电泳检测及Western Blot分析 | 第51页 |
| 5.11 本章小结 | 第51-53页 |
| 6 Ps-BD2的分离纯化及生物学功能验证 | 第53-59页 |
| 6.1 前言 | 第53页 |
| 6.2 材料与仪器 | 第53-54页 |
| 6.2.1 Ps-BD2的分离纯化所需材料与仪器 | 第53页 |
| 6.2.2 Ps-BD2生物学活性检测所需材料与仪器 | 第53-54页 |
| 6.3 实验方法 | 第54-56页 |
| 6.3.1 Ps-BD2的分离纯化 | 第54页 |
| 6.3.2 rPs-BD2抗菌活性检测 | 第54-55页 |
| 6.3.3 rPs-BD2溶血活性检测 | 第55页 |
| 6.3.4 rPs-BD2细胞毒性检测 | 第55-56页 |
| 6.4 实验结果与讨论 | 第56-58页 |
| 6.4.1 rPS-BD2的分离纯化 | 第56-57页 |
| 6.4.2 rPs-BD2的抗菌活性 | 第57页 |
| 6.4.3 rPs-BD2的溶血活性及细胞毒性 | 第57-58页 |
| 6.5 本章小结 | 第58-59页 |
| 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 附录A：重组质粒pPIC9K-Ps-BD2的测序鉴定 | 第65-66页 |
| 硕士期间发表学术论文情况 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-69页 |
