| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第16-18页 |
| 第1章 绪论 | 第18-31页 |
| 1.1 研究背景 | 第18-20页 |
| 1.1.1 圆锥铁线莲简介 | 第18-19页 |
| 1.1.2 紫外逆境对植物的影响 | 第19-20页 |
| 1.2 吲哚类次生代谢产物研究进展 | 第20-24页 |
| 1.2.1 吲哚类次生代谢产物的分类及其功效 | 第20-21页 |
| 1.2.2 吲哚生物碱在药用植物中的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.2.3 吲哚生物碱的合成现状 | 第22-24页 |
| 1.3 腺苷酸异戊烯基转移酶(IPT)研究进展 | 第24-27页 |
| 1.3.1 IPT简介 | 第24-25页 |
| 1.3.2 IPT研究方法的发展 | 第25-27页 |
| 1.3.3 IPT研究现状 | 第27页 |
| 1.4 本文的研究目的、内容与意义 | 第27-31页 |
| 1.4.1 圆锥铁线莲中吲哚生物碱响应UV-B诱导的合成机理 | 第27-29页 |
| 1.4.2 圆锥铁线莲中腺苷酸异戊烯基转移酶的克隆与原核表达 | 第29-31页 |
| 第2章 圆锥铁线莲中吲哚生物碱响应UV-B诱导的合成机理 | 第31-64页 |
| 2.1 前言 | 第31-32页 |
| 2.2 材料 | 第32-34页 |
| 2.2.1 植物来源与鉴定 | 第32页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第32-33页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.3 方法 | 第34-42页 |
| 2.3.1 样品处理 | 第34页 |
| 2.3.2 化合物提取和高效液相色谱-质谱分析 | 第34-35页 |
| 2.3.3 化合物提取和气相色谱-质谱分析 | 第35-36页 |
| 2.3.4 qRT-PCR | 第36-39页 |
| 2.3.5 酶活 | 第39-41页 |
| 2.3.6 数据分析 | 第41-42页 |
| 2.4 结果 | 第42-59页 |
| 2.4.1 UV-B诱导圆锥铁线莲吲哚生物碱含量增加 | 第42页 |
| 2.4.2 蛋白质组学研究证明UV-B诱导后圆锥铁线莲氨基酸代谢增强 | 第42-47页 |
| 2.4.3 代谢组学研究证明UV-B诱导后圆锥铁线莲氨基酸代谢增强 | 第47-55页 |
| 2.4.4 蛋白质组与代谢组的整合分析 | 第55-56页 |
| 2.4.5 圆锥铁线莲经过UV-B诱导后体内莽草酸代谢途径和吲哚生物合成途径中的关键基因表达上调 | 第56-57页 |
| 2.4.6 圆锥铁线莲经过UV-B诱导后吲哚生物合成途径中的关键代谢物增加 | 第57-58页 |
| 2.4.7 圆锥铁线莲经过UV-B诱导后吲哚生物合成途径中的关键酶活性增加 | 第58-59页 |
| 2.5 讨论 | 第59-62页 |
| 2.5.1 氨基酸代谢的激活促进了莽草酸代谢途径的增强 | 第59页 |
| 2.5.2 莽草酸代谢途径的增强促进了吲哚/色氨酸的积累 | 第59-61页 |
| 2.5.3 紫外诱导激活了吲哚生物碱代谢流途径的协同响应 | 第61-62页 |
| 2.6 小结 | 第62-64页 |
| 第3章 圆锥铁线莲中腺苷酸异戊烯基转移酶的克隆与原核表达 | 第64-98页 |
| 3.1 前言 | 第64-65页 |
| 3.2 材料 | 第65-67页 |
| 3.2.1 样品 | 第65页 |
| 3.2.2 质粒与菌株 | 第65页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第65-67页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第67页 |
| 3.3 方法 | 第67-83页 |
| 3.3.1 溶液及培养基 | 第67-69页 |
| 3.3.1.1 蛋白表达和相关培养基的试剂配制 | 第67-68页 |
| 3.3.1.2 SDS-PAGE相关试剂配制 | 第68-69页 |
| 3.3.1.3 蛋白纯化相关试剂配制 | 第69页 |
| 3.3.2 目的序列的获取 | 第69-73页 |
| 3.3.2.1 Total RNA提取 | 第69页 |
| 3.3.2.2 转录组EST序列分析 | 第69-70页 |
| 3.3.2.3 RACE技术获得目的基因cDNA序列 | 第70-73页 |
| 3.3.2.4 目的序列验证 | 第73页 |
| 3.3.3 CtIPT生物信息学分析 | 第73-74页 |
| 3.3.3.1 蛋白性质分析 | 第73页 |
| 3.3.3.2 氨基酸序列对比分析 | 第73-74页 |
| 3.3.3.3 系统进化分析 | 第74页 |
| 3.3.4 圆锥铁线莲CtIPT基因在UV-B诱导后的表达情况 | 第74-75页 |
| 3.3.4.1 Total RNA提取 | 第74页 |
| 3.3.4.2 cDNA第一条链的合成 | 第74页 |
| 3.3.4.3 引物设计和合成 | 第74页 |
| 3.3.4.4 CtIPT基因的表达分析 | 第74-75页 |
| 3.3.5 CtIPT基因原核表达载体的构建 | 第75-80页 |
| 3.3.5.1 带有酶切位点引物设计和合成 | 第75页 |
| 3.3.5.2 PCR扩增和PCR产物纯化 | 第75-76页 |
| 3.3.5.3 PCR产物及质粒双酶切和酶切产物柱纯化 | 第76-77页 |
| 3.3.5.4 CtIPT与质粒重组连接 | 第77-78页 |
| 3.3.5.5 大肠杆菌感受态的制备和转化 | 第78-79页 |
| 3.3.5.6 连接产物的鉴定 | 第79-80页 |
| 3.3.6 CtIPT在大肠杆菌中的表达 | 第80-82页 |
| 3.3.6.1 表达条件 | 第80页 |
| 3.3.6.2 表达产物SDS-PAGE分析 | 第80-82页 |
| 3.3.7 CtIPT重组蛋白(含MBP标签)的分离纯化 | 第82-83页 |
| 3.3.7.1 Amylose resin亲和层析柱的预处理 | 第82页 |
| 3.3.7.2 样品制备和上样 | 第82页 |
| 3.3.7.3 CtIPT重组蛋白洗脱 | 第82-83页 |
| 3.4 结果 | 第83-96页 |
| 3.4.1 目的序列 | 第83-87页 |
| 3.4.1.1 蛋白性质分析 | 第84-85页 |
| 3.4.1.2 氨基酸序列对比分析 | 第85-86页 |
| 3.4.1.3 系统进化分析 | 第86-87页 |
| 3.4.2 CtIPT在圆锥铁线莲中经UV-B诱导后的表达情况 | 第87-88页 |
| 3.4.3 以pET-28a(+)为载体对CtIPT基因进行原核表达 | 第88-91页 |
| 3.4.3.1 pET-28a(+)-C tIPT表达载体构建及验证 | 第88-90页 |
| 3.4.3.2 BL21- pET-28a(+)-CtIPT诱导表达 | 第90-91页 |
| 3.4.4 以pGEX-4T-1为载体对CtIPT基因进行原核表达 | 第91-93页 |
| 3.4.4.1 pGEX-4T-1-CtIPT表达载体构建及验证 | 第91-92页 |
| 3.4.4.2 BL21- pGEX-4T-1-CtIPT诱导表达 | 第92-93页 |
| 3.4.5 以pMAL-c2X为载体对CtIPT基因进行原核表达 | 第93-96页 |
| 3.4.5.1 pMAL-c2X-CtIPT表达载体构建及验证 | 第93-94页 |
| 3.4.5.2 BL21- pMAL-c2X-CtIPT诱导表达 | 第94-95页 |
| 3.4.5.3 分离纯化 | 第95-96页 |
| 3.5 讨论 | 第96-97页 |
| 3.5.1 UV-B诱导能调控CtIPT的表达进而可能增加圆锥铁线莲的抗逆性 | 第96页 |
| 3.5.2 CtIPT可能通过UV-B通路中的调控因子而与次生代谢产物相互关联 | 第96-97页 |
| 3.6 小结 | 第97-98页 |
| 第4章 总结与展望 | 第98-101页 |
| 4.1 总结 | 第98-99页 |
| 4.2 展望 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-115页 |
| 作者简介 | 第115-116页 |
