| 摘要 | 第10-15页 |
| ABSTRACT | 第15-20页 |
| 缩略语 | 第21-22页 |
| 第一章 研究背景 | 第22-34页 |
| 1.1 微生物体内的硫氧化简介 | 第22页 |
| 1.2 嗜酸性喜温硫杆菌简介 | 第22-25页 |
| 1.2.1 嗜酸性喜温硫杆菌的生理特性 | 第23页 |
| 1.2.2 嗜酸性喜温硫杆菌的硫氧化系统 | 第23-24页 |
| 1.2.3 嗜酸性喜温硫杆菌tetH基因簇的简介 | 第24-25页 |
| 1.3 双组分调控系统 | 第25-29页 |
| 1.3.1 双组分调控系统的基本组成和作用机制 | 第25页 |
| 1.3.2 双组分调控系统的分类 | 第25-26页 |
| 1.3.3 组氨酸激酶(HK)的结构 | 第26-27页 |
| 1.3.4 响应调控蛋白(RR)的结构 | 第27-28页 |
| 1.3.5 嗜酸性喜温硫杆菌中的双组分调控系统 | 第28-29页 |
| 1.4 嗜酸性喜温硫杆菌遗传操作系统 | 第29-32页 |
| 1.4.1 嗜酸性喜温硫杆菌的接合转移系统 | 第29-30页 |
| 1.4.2 嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除技术 | 第30-32页 |
| 1.5 本文的研究目的、内容及意义 | 第32-34页 |
| 1.5.1 研究目的 | 第32-33页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第33页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第33-34页 |
| 第二章 A.caldus MTH-04硫能源培养过程的基因表达谱分析 | 第34-51页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 材料与方法 | 第34-38页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第34页 |
| 2.2.2 培养基和培养条件 | 第34-35页 |
| 2.2.3 试剂和仪器 | 第35-36页 |
| 2.2.4 实验方法 | 第36-38页 |
| 2.2.4.1 细菌培养 | 第36页 |
| 2.2.4.2 A.caldus总RNA的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.4.3 RNA样品浓度和纯度的检测 | 第37页 |
| 2.2.4.4 RNA样品的完整性检测 | 第37页 |
| 2.2.4.5 基因表达谱芯片实验 | 第37-38页 |
| 2.3 研究结果 | 第38-50页 |
| 2.3.1 A.caldus培养的优化及pH检测 | 第38-41页 |
| 2.3.1.1 A.caldus硫粉能源浓度的优化 | 第38-39页 |
| 2.3.1.2 培养过程中pH值变化 | 第39-41页 |
| 2.3.2 A.caldus以硫粉为能源培养过程中的基因表达谱分析 | 第41-50页 |
| 2.3.2.1 样品收集 | 第41页 |
| 2.3.2.2 RNA样品的提取 | 第41-42页 |
| 2.3.2.3 芯片杂交结果数据分析 | 第42-45页 |
| 2.3.2.4 硫代谢基因过程表达的变化分析 | 第45-47页 |
| 2.3.2.5 双组分调控系统及其在硫代谢中的调控作用 | 第47-50页 |
| 2.4 结果讨论 | 第50-51页 |
| 第三章 嗜酸性喜温硫杆菌中tetH基因簇的分析研究 | 第51-66页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 材料和方法 | 第51-57页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第51-53页 |
| 3.2.2 培养基和培养条件 | 第53页 |
| 3.2.3 试剂和仪器 | 第53-54页 |
| 3.2.4 分子生物学相关操作技术 | 第54-57页 |
| 3.2.4.1 E.coli中的GusA酶活测定 | 第54页 |
| 3.2.4.2 cDNA末端快速扩增技术(RACE) | 第54-56页 |
| 3.2.4.3 T载体连接转化 | 第56-57页 |
| 3.3 研究结果 | 第57-65页 |
| 3.3.1 tetH基因簇的比较分析 | 第57-59页 |
| 3.3.2 tetH基因簇中的启动子分析 | 第59-60页 |
| 3.3.3 tetH基因簇中可能的启动子功能的验证 | 第60-63页 |
| 3.3.3.1 报告基因gusA检测方法 | 第60-62页 |
| 3.3.3.2 喜温硫杆菌中gusA基因转录检测 | 第62-63页 |
| 3.3.4 cDNA末端快速扩增结果 | 第63-65页 |
| 3.4 结果讨论 | 第65-66页 |
| 第四章 嗜酸性喜温硫杆菌中双组分调控系统RsrS-RsrR编码基因的无痕敲除 | 第66-82页 |
| 4.1 引言 | 第66页 |
| 4.2 材料和方法 | 第66-72页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第66-68页 |
| 4.2.2 培养基和培养条件 | 第68页 |
| 4.2.3 试剂和仪器 | 第68页 |
| 4.2.4 分子生物学相关操作技术 | 第68-72页 |
| 4.2.4.1 PCR扩增 | 第68-69页 |
| 4.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第69-70页 |
| 4.2.4.3 核酸回收操作 | 第70页 |
| 4.2.4.4 细菌质粒提取操作 | 第70页 |
| 4.2.4.5 细菌基因组提取操作 | 第70页 |
| 4.2.4.6 限制性酶切操作及反应体系 | 第70-71页 |
| 4.2.4.7 T4 DNA连接酶反应体系及条件 | 第71页 |
| 4.2.4.8 连接液或质粒转化感受态细胞 | 第71-72页 |
| 4.2.4.9 引物合成及测序 | 第72页 |
| 4.2.4.10 接合转移操作 | 第72页 |
| 4.3 研究结果 | 第72-81页 |
| 4.3.1 同源重组的自杀型质粒pSDUDI::rsrR (UHA+DHA)和pSDUDI::rsrS (UHA+DHA)的构建 | 第72-75页 |
| 4.3.2 自杀质粒的接合转移 | 第75页 |
| 4.3.3 单交换子的筛选 | 第75-77页 |
| 4.3.3.1 rsrR单交换子的筛选 | 第75-76页 |
| 4.3.3.2 rsrS单交换子的筛选 | 第76-77页 |
| 4.3.4 敲除株的筛选 | 第77-80页 |
| 4.3.4.1 rsrR敲除株的筛选 | 第77-78页 |
| 4.3.4.2 rsrS敲除株的筛选 | 第78-80页 |
| 4.3.5 回补菌株的构建 | 第80-81页 |
| 4.3.5.1 rsrR回补质粒的构建 | 第80页 |
| 4.3.5.2 rsrS回补质粒的构建 | 第80-81页 |
| 4.3.5.3 回补质粒接合入敲除株 | 第81页 |
| 4.4 结果讨论 | 第81-82页 |
| 第五章 △rsrR、△rsrS生长曲线测定及连四硫酸盐刺激研究 | 第82-94页 |
| 5.1 引言 | 第82页 |
| 5.2 材料和方法 | 第82-89页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第82-83页 |
| 5.2.2 培养基和培养条件 | 第83页 |
| 5.2.3 试剂和仪器 | 第83页 |
| 5.2.4 分子生物学相关操作技术 | 第83-89页 |
| 5.2.4.1 A.caldus生长曲线测定 | 第84页 |
| 5.2.4.2 Trizol法提取RNA | 第84-85页 |
| 5.2.4.3 去除基因组DNA及RNA反转录 | 第85-86页 |
| 5.2.4.4 RT-qPCR技术 | 第86-88页 |
| 5.2.4.5 生物统计学分析 | 第88-89页 |
| 5.3 研究结果 | 第89-92页 |
| 5.3.1 生长曲线差异对比 | 第89-91页 |
| 5.3.1.1 敲除株的生长曲线 | 第89-90页 |
| 5.3.1.2 回补菌株的生长曲线 | 第90-91页 |
| 5.3.2 tetH基因簇的转录分析 | 第91-92页 |
| 5.3.2.1 以水刺激对照组 | 第91-92页 |
| 5.3.2.2 以连四硫酸盐刺激实验组 | 第92页 |
| 5.4 结果讨论 | 第92-94页 |
| 第六章 △rsrR、△rsrS中硫代谢相关基因及调控系统基因的转录分析研究 | 第94-109页 |
| 6.1 引言 | 第94页 |
| 6.2 材料与方法 | 第94-95页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第94-95页 |
| 6.2.2 培养基和培养条件 | 第95页 |
| 6.2.3 试剂和仪器 | 第95页 |
| 6.2.4 分子生物学相关操作技术 | 第95页 |
| 6.2.4.1 Trizol法提取RNA | 第95页 |
| 6.2.4.2 本章中使用的RT-qPCR引物 | 第95页 |
| 6.3 研究结果 | 第95-107页 |
| 6.3.1 △rsrR敲除株与野生型在培养过程中硫代谢基因的差异表达 | 第95-99页 |
| 6.3.2 △rsrS敲除株与野生型在培养过程中硫代谢基因的差异表达 | 第99-102页 |
| 6.3.3 △rsrR敲除株与野生型在培养过程中双组分系统(TCS)及单组分系统(SCS)基因的差异表达 | 第102-105页 |
| 6.3.4 △rsrS敲除株与野生型在培养过程中双组分系统(TCS)及单组分系统(SCS)基因的差异表达 | 第105-107页 |
| 6.4 结果讨论 | 第107-109页 |
| 第七章 RsrS-RsrR对S_4I途径的调控功能研究 | 第109-128页 |
| 7.1 引言 | 第109页 |
| 7.2 材料和方法 | 第109-115页 |
| 7.2.1 菌株和质粒 | 第109-111页 |
| 7.2.2 培养基和培养条件 | 第111页 |
| 7.2.3 试剂和仪器 | 第111页 |
| 7.2.4 分子生物学相关操作技术 | 第111-115页 |
| 7.2.4.1 蛋白异源表达 | 第111-112页 |
| 7.2.4.2 蛋白纯化 | 第112-113页 |
| 7.2.4.3 蛋白浓缩 | 第113页 |
| 7.2.4.4 蛋白浓度测定 | 第113页 |
| 7.2.4.5 凝胶迁移实验 | 第113-114页 |
| 7.2.4.6 DNase Ⅰ足迹实验 | 第114-115页 |
| 7.3 研究结果 | 第115-126页 |
| 7.3.1 pET-22b-rsrR表达菌株构建 | 第115-116页 |
| 7.3.2 RsrR蛋白表达和纯化 | 第116-117页 |
| 7.3.3 目的片段的扩增 | 第117-119页 |
| 7.3.3.1 阴性对照片段G360的扩增 | 第117页 |
| 7.3.3.2 tetH启动子片段的扩增 | 第117-119页 |
| 7.3.4 EMSA验证结果 | 第119-122页 |
| 7.3.4.1 梯度浓度RsrR蛋白与T360片段的结合实验 | 第119-120页 |
| 7.3.4.2 RsrR蛋白与T360,T148和T90片段的结合实验 | 第120-121页 |
| 7.3.4.3 RsrR蛋白与G360+58IRS片段的结合实验 | 第121页 |
| 7.3.4.4 RsrR蛋白与T360△19片段的结合实验 | 第121-122页 |
| 7.3.5 DNaseⅠ足迹实验 | 第122-123页 |
| 7.3.6 RsrR蛋白与调控序列体内验证质粒的构建 | 第123-125页 |
| 7.3.7 在△rsrR和野生型中互作验证质粒的gusA转录分析 | 第125-126页 |
| 7.4 结果讨论 | 第126-128页 |
| 第八章 RsrS和RsrR进化结构分析及其它非同源双组分调控蛋白(RR)的初步研究 | 第128-142页 |
| 8.1 引言 | 第128页 |
| 8.2 材料和方法 | 第128-131页 |
| 8.2.1 菌株和质粒 | 第128-129页 |
| 8.2.2 培养基和培养条件 | 第129页 |
| 8.2.3 试剂和仪器 | 第129页 |
| 8.2.4 分子生物学相关操作技术 | 第129-131页 |
| 8.2.4.1 生物进化树分析 | 第130页 |
| 8.2.4.2 结构生物学模拟 | 第130-131页 |
| 8.2.4.3 蛋白氨基酸位点突变 | 第131页 |
| 8.3 研究结果 | 第131-140页 |
| 8.3.1 进化树分析 | 第131-132页 |
| 8.3.1.1 RsrR蛋白的进化树分析 | 第131-132页 |
| 8.3.1.2 RsrS蛋白的进化树分析 | 第132页 |
| 8.3.2 蛋白结构分析 | 第132-135页 |
| 8.3.2.1 RsrR蛋白结构分析及模拟叠合 | 第132-134页 |
| 8.3.2.2 RsrS蛋白结构分析及模拟叠合 | 第134-135页 |
| 8.3.3 tetH启动子序列与其它双组分调控蛋白(RR)的互作研究 | 第135-136页 |
| 8.3.3.1 其它双组分调控蛋白(RR)表达菌株的构建 | 第135-136页 |
| 8.3.3.2 其它双组分调控蛋白(RR)与tetH启动子序列的EMSA结果 | 第136页 |
| 8.3.4 RsrR蛋白关键氨基酸位点的分析 | 第136-139页 |
| 8.3.4.1 RsrR蛋白HTH结构域关键氨基酸位点的分析 | 第136-137页 |
| 8.3.4.2 RsrR蛋白R184位点的敲除株构建 | 第137-138页 |
| 8.3.4.3 RsrR蛋白L214位点的敲除株构建 | 第138页 |
| 8.3.4.4 RsrR(R184A)蛋白与tetH启动子序列的EMSA结果 | 第138-139页 |
| 8.3.4.5 RsrR(L214A)蛋白与tetH启动子序列的EMSA结果 | 第139页 |
| 8.3.5 RsrS-RsrR调控S_4I途径的基本模型的提出 | 第139-140页 |
| 8.4 结果讨论 | 第140-142页 |
| 全文总结与展望 | 第142-144页 |
| 附录 | 第144-149页 |
| 参考文献 | 第149-157页 |
| 攻读学位期间学术成果 | 第157-158页 |
| 致谢 | 第158-159页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第159页 |
