| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-9页 |
| 縮写 | 第9-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-16页 |
| 一、植物根际促生菌(PGPR) | 第10-11页 |
| 二、丙烯酰胺及酰胺水解酶的研究 | 第11-14页 |
| 1、丙烯酰胺概述 | 第11-12页 |
| 2、酰胺酶研究背景 | 第12-14页 |
| ·酰胺酶来源 | 第12页 |
| ·酰胺酶的分类 | 第12-13页 |
| ·酰胺酶的生物催化机制 | 第13-14页 |
| 三、本文的研究思路 | 第14-16页 |
| 第二章 V.boronicumulans CGMCC 4969的降解特性及PGPR特性研究 | 第16-30页 |
| 第一节 V.boronicumulans CGMCC 4969降解底物特性的研究 | 第16-25页 |
| 1. 实验材料 | 第16-17页 |
| ·菌株 | 第16页 |
| ·培养基的配制 | 第16-17页 |
| ·主要试剂及来源 | 第17页 |
| ·主要仪器设备及来源 | 第17页 |
| ·主要溶液配制 | 第17页 |
| 2. 实验方法 | 第17-19页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969静息细胞转化氰基吡啶 | 第17-18页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969静息细胞转化丙烯酰胺 | 第18页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969生长转化丙烯酰胺 | 第18页 |
| ·丙烯酰胺的土壤降解 | 第18-19页 |
| ·产NH_3的标准曲线的制作及测定 | 第19页 |
| ·丙烯酰胺降解标准曲线的制作 | 第19页 |
| ·HPLC检测 | 第19页 |
| 3 实验结果 | 第19-24页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969静息细胞转化氰基吡啶结果 | 第19-20页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969静息细胞转化丙烯酰胺结果 | 第20-21页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969生长细胞转化丙烯酰胺 | 第21-22页 |
| ·丙烯酰胺土壤降解 | 第22-23页 |
| ·NH_3标准曲线 | 第23页 |
| ·丙烯酰胺标准曲线的制作 | 第23-24页 |
| 4 讨论 | 第24-25页 |
| 第二节 V.boronicumulans CGMCC 4969的PGPR特性研究 | 第25-30页 |
| 1. 实验材料与仪器设备 | 第25-26页 |
| ·主要试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器设备 | 第25页 |
| ·培养基配制 | 第25-26页 |
| ·主要溶液配制 | 第26页 |
| 2. 实验方法 | 第26-27页 |
| ·吲哚乙酸(IAA)的测定 | 第26页 |
| ·胞外多糖(EPS)的测定 | 第26页 |
| ·铁载体的测定 | 第26-27页 |
| ·溶磷性质研究 | 第27页 |
| ·产生HCN的检测 | 第27页 |
| ·产生NH_3的测定 | 第27页 |
| 3. 实验结果 | 第27-29页 |
| ·吲哚乙酸测定结果 | 第27页 |
| ·胞外多糖(EPS)测定结果 | 第27页 |
| ·铁载体的测定结果 | 第27-28页 |
| ·溶磷能力研究结果 | 第28页 |
| ·产生HCN测定结果 | 第28页 |
| ·产生NH_3的测定 | 第28-29页 |
| 4. 讨论 | 第29-30页 |
| 第三章 V.boronicumulans CGMCC 4969酰胺酶基因的克隆表达及酶活检测 | 第30-59页 |
| 第一节 V.boronicumulans CGMCC 4969酰胺酶基因的克隆 | 第30-41页 |
| 1. 实验材料 | 第30-32页 |
| ·菌株和质粒 | 第30页 |
| ·培养基的配制 | 第30页 |
| ·主要试剂及来源 | 第30页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第30-31页 |
| ·主要溶液配制 | 第31页 |
| ·酶 | 第31页 |
| ·PCR引物 | 第31-32页 |
| ·其他材料 | 第32页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第32页 |
| 2. 实验方法 | 第32-37页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第32页 |
| ·设计引物进行PCR扩增 | 第32-35页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第35页 |
| ·PCR产物装TA克隆 | 第35-36页 |
| ·感受态细胞制备及转化 | 第36页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第36-37页 |
| ·测序验证 | 第37页 |
| 3. 实验结果 | 第37-40页 |
| ·V.boronicumulans CGMCC 4969基因组的提取 | 第37-38页 |
| ·PCR结果 | 第38页 |
| ·阳性克隆的筛选结果 | 第38-39页 |
| ·测序、拼接及序列比对结果 | 第39-40页 |
| 4. 讨论 | 第40-41页 |
| 第二节 酰胺酶的过表达及酶活检测 | 第41-59页 |
| 1. 实验材料 | 第42-44页 |
| ·菌种和质粒 | 第42页 |
| ·培养基的配制 | 第42页 |
| ·主要试剂及来源 | 第42页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第42-43页 |
| ·主要溶液配制 | 第43页 |
| ·酶 | 第43-44页 |
| ·PCR引物 | 第44页 |
| ·其他材料 | 第44页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第44页 |
| 2. 实验方法 | 第44-52页 |
| ·PCR扩增 | 第44-45页 |
| ·PCR产物纯化回收 | 第45页 |
| ·制备含粘性末端的DNA片段 | 第45-47页 |
| ·构建表达载体并转化至E.coli BL21 | 第47-48页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第48-49页 |
| ·SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况 | 第49-50页 |
| ·Western blot检测目的蛋白的表达情况 | 第50-51页 |
| ·酰胺酶活性分析 | 第51-52页 |
| 3. 实验结果 | 第52-58页 |
| ·PCR结果 | 第52-53页 |
| ·阳性克隆筛选结果 | 第53-54页 |
| ·目的片段连pET-28a表达载体 | 第54-55页 |
| ·目的基因诱导表达SDS-PAGE电泳结果 | 第55-56页 |
| ·Western blot结果 | 第56页 |
| ·酰胺酶活性结果 | 第56-58页 |
| 4. 讨论 | 第58-59页 |
| 总结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附件 | 第66-68页 |
| 附件一：在读研究生期间主要科研情况 | 第66-67页 |
| 附件二：V.boronicumulans CGMCC4969菌株酰胺酶基因核酸序列 | 第67-68页 |
| 附件三：V.boronicumulans CGMCC4969菌株酰胺酶氨基酸序列 | 第68页 |
