| 名词缩写 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-17页 |
| ·融合表达载体的构建和应用 | 第12-13页 |
| ·N-乙酰-D-神经氨酸的酶法合成 | 第13-17页 |
| 第二章 融合表达载体的构建和应用 | 第17-30页 |
| ·实验材料 | 第17-20页 |
| ·菌株与质粒 | 第17页 |
| ·培养基 | 第17页 |
| ·主要试剂及溶液 | 第17-18页 |
| ·主要仪器设备 | 第18-19页 |
| ·引物表和质粒表 | 第19-20页 |
| ·实验方法 | 第20-25页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第20-21页 |
| ·DNA片段的回收 | 第21页 |
| ·E. coli DH10B感受态细胞的制备 | 第21页 |
| ·DNA转化 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的提取和酶切鉴定 | 第22页 |
| ·制备蛋白胶及SDS-PAGE | 第22-23页 |
| ·系列融合表达载体的构建 | 第23-24页 |
| ·异源基因的克隆和融合表达 | 第24-25页 |
| ·融合蛋白的纯化和酶切 | 第25页 |
| ·融合蛋白的TEV酶切 | 第25页 |
| ·实验结果 | 第25-29页 |
| ·双标签融合表达载体的构建 | 第25-26页 |
| ·TEV蛋白的表达和纯化 | 第26-27页 |
| ·mMBP融合蛋白的表达,分离纯化和TEV酶切 | 第27-29页 |
| ·讨论 | 第29-30页 |
| 第三章 双酶偶联催化合成N-乙酰-D-神经氨酸 | 第30-54页 |
| 第一节 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的筛选 | 第30-36页 |
| ·实验材料 | 第30-31页 |
| ·蛋白表达菌株 | 第30-31页 |
| ·主要试剂的配置 | 第31页 |
| ·实验方法 | 第31-32页 |
| ·TBA法测定神经氨酸含量 | 第31-32页 |
| ·异构酶全细胞酶液的准备 | 第32页 |
| ·异构酶活性的测定 | 第32页 |
| ·实验结果 | 第32-35页 |
| ·TBA法测定神经氨酸含量标准曲线的建立 | 第32-33页 |
| ·十种异构酶活性的比较 | 第33-34页 |
| ·PCC7120和BT0453酶活的比较 | 第34-35页 |
| ·Mg~(2+)浓度 | 第34页 |
| ·ATP浓度 | 第34-35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| 第二节 BT0453和NanA的双酶偶联催化 | 第36-47页 |
| ·实验材料 | 第36页 |
| ·主要试剂的配置 | 第36页 |
| ·主要仪器设备 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-37页 |
| ·测定神经氨酸含量的方法 | 第36-37页 |
| ·TBA法 | 第36页 |
| ·HPLC | 第36-37页 |
| ·色谱条件 | 第36-37页 |
| ·BT0453和NanA双酶偶联催化合成Neu5Ac | 第37页 |
| ·全细胞酶液的准备 | 第37页 |
| ·双酶偶联催化体系 | 第37页 |
| ·实验结果 | 第37-46页 |
| ·HPLC测定各物质摩尔量标准曲线的建立 | 第37-40页 |
| ·蛋白浓度标曲的建立 | 第40页 |
| ·BT0453和NanA双酶偶联催化合成Neu5Ac | 第40-46页 |
| ·1ml双酶偶联反应体系 | 第40-42页 |
| ·异构酶和醛缩酶的酶活单位比例 | 第40-41页 |
| ·酶活单位 | 第41页 |
| ·ATP浓度 | 第41-42页 |
| ·10ml双酶偶联反应体系 | 第42-43页 |
| ·Mg~(2+)浓度 | 第42-43页 |
| ·100ml双酶偶联反应体系 | 第43-46页 |
| ·酶活比例 | 第43-44页 |
| ·补料处理 | 第44-46页 |
| ·讨论 | 第46-47页 |
| 第三节 PCC7120的点突变 | 第47-54页 |
| ·实验材料 | 第47-48页 |
| ·引物表和质粒表 | 第47-48页 |
| ·实验方法 | 第48-49页 |
| ·系列点突变载体的构建 | 第48-49页 |
| ·突变的PCC7120异构酶全细胞酶液的准备 | 第49页 |
| ·实验结果 | 第49-53页 |
| ·不同目的基因点突变的扩增 | 第49-50页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第50页 |
| ·突变后的PCC7120的诱导表达 | 第50-52页 |
| ·突变后的PCC7120酶活的比较 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |