| 中文摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-30页 |
| ·基因无义突变的研究进展 | 第20-28页 |
| ·无义突变概述 | 第20-21页 |
| ·无义突变引发NMD途径 | 第21-26页 |
| ·无义突变引发NAS途径 | 第26-27页 |
| ·无义突变导致遗传性疾病的治疗 | 第27-28页 |
| ·血友病的研究进展 | 第28-29页 |
| ·血友病概述 | 第28页 |
| ·血友病的治疗 | 第28页 |
| ·无义突变引发血友病的现状 | 第28-29页 |
| ·实验材料及本课题的研究意义 | 第29-30页 |
| ·凝血因子IX基因 | 第29页 |
| ·本课题的目的与意义 | 第29-30页 |
| 第二章 人凝血因子IX小基因及其无义突变体的构建与表达 | 第30-46页 |
| ·实验材料 | 第30-31页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第30页 |
| ·酶及试剂 | 第30-31页 |
| ·实验方法 | 第31-35页 |
| ·Mini-hF9基因的构建 | 第31-32页 |
| ·重组表达质粒pCMV-MH-Mini-hF9的构建 | 第32-33页 |
| ·Mini-hF9基因无义突变体的构建 | 第33-34页 |
| ·细胞转染级质粒的制备 | 第34页 |
| ·细胞培养 | 第34页 |
| ·细胞转染 | 第34页 |
| ·RT-PCR分析 | 第34-35页 |
| ·Western Blot分析 | 第35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-45页 |
| ·Mini-hF9基因的构建 | 第36-38页 |
| ·重组表达质粒pCMV-MH-Mini-hF9的构建 | 第38-39页 |
| ·Mini-hF9基因无义突变体的构建 | 第39页 |
| ·Mini-hF9基因在细胞中的表达鉴定 | 第39-42页 |
| ·Mini-hF9基因及其无义突变体在细胞中的表达 | 第42-45页 |
| ·小结 | 第45-46页 |
| 第三章 人凝血因子IX小基因不同无义突变位置是否引发NMD途径的研究 | 第46-62页 |
| ·实验材料 | 第46页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第46页 |
| ·酶和试剂 | 第46页 |
| ·实验方法 | 第46-50页 |
| ·干扰质粒pSIR-hUPF1和pSIR-hSMG1的构建 | 第46-48页 |
| ·细胞培养、转染与药物处理 | 第48页 |
| ·Western Blot检测UPF1和SMG1的干扰效率 | 第48-49页 |
| ·qRT-PCR检测mRNA水平变化情况 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-61页 |
| ·Mini-hF9基因及其无义突变体中Norm mRNA水平的检测 | 第50-55页 |
| ·放线菌酮(CHX)处理细胞后Norm mRNA水平变化情况 | 第55页 |
| ·干扰质粒pSIR-hUPF1和pSIR-hSMG1的构建 | 第55-56页 |
| ·干扰质粒pSIR-hUPF1和pSIR-hSMG1干扰效率的测定 | 第56-58页 |
| ·干扰UPF1或SMG1后Norm mRNA水平变化情况 | 第58-61页 |
| ·小结 | 第61-62页 |
| 第四章 microRNA-125调节NMD途径机制的研究 | 第62-76页 |
| ·实验材料 | 第62-63页 |
| ·细胞、菌株、质粒与microRNA mimic、microRNA inhibitor | 第62页 |
| ·酶及试剂 | 第62-63页 |
| ·实验方法 | 第63-65页 |
| ·TargetScan预测SMG1 mRNA上的microRNA靶位点 | 第63页 |
| ·重组质粒pmirGLO-SMG1-WT和pmirGLO-SMG1-MU的构建 | 第63-65页 |
| ·细胞培养、转染 | 第65页 |
| ·双荧光素酶报告分析 | 第65页 |
| ·Western Blot检测细胞内源SMG1蛋白水平 | 第65页 |
| ·qRT-PCR检测细胞内源SMG1 mRNA水平 | 第65页 |
| ·qRT-PCR检测NMD靶基因mRNA水平 | 第65页 |
| ·结果与讨论 | 第65-75页 |
| ·SMG1 mRNA 3'-UTR上潜在的miRNA靶位点 | 第66页 |
| ·重组质粒pmirGLO-SMG1-WT和pmirGLO-SMG1-MU的构建 | 第66页 |
| ·双荧光素酶报告分析结果 | 第66-69页 |
| ·miR-125抑制SMG1的表达 | 第69-70页 |
| ·miR-125通过降解mRNA来下调SMG1的表达 | 第70-72页 |
| ·miR-125通过下调SMG1的表达进而抑制NMD途径 | 第72-75页 |
| ·小结 | 第75-76页 |
| 第五章 人凝血因子IX小基因无义突变引发NAS途径的鉴定 | 第76-86页 |
| ·实验材料 | 第76页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第76页 |
| ·酶和试剂 | 第76页 |
| ·实验方法 | 第76-78页 |
| ·结果与讨论 | 第78-85页 |
| ·Mini-hF9基因Exon 7 上ESE序列的预测 | 第78页 |
| ·突变质粒pCMV-MH-Mini-hF9-E7aE、pCMV-MH-Mini-hF9-E7bE、pCMV-MH-Mini-hF9-E7cE的构建 | 第78-79页 |
| ·RT-PCR分析突变体mRNA剪接变化 | 第79-80页 |
| ·干扰质粒pSIR-hUPF2、pSIR-hSMG6的构建 | 第80页 |
| ·qRT-PCR检测Mini-hF9基因及其无义突变体中选择性剪接体AI t-S1 mRNA和Alt-S2 mRNA的水平 | 第80-83页 |
| ·qRT-PCR检测干扰UPF2后Mini-hF9基因及其无义突变体中Alt-S1 mRNA及Norm mRNA水平的变化 | 第83-85页 |
| ·小结 | 第85-86页 |
| 第六章 含人凝血因子IX小基因及其无义突变体的稳定细胞株的建立 | 第86-92页 |
| ·实验材料 | 第86页 |
| ·细胞、菌株与质粒 | 第86页 |
| ·酶及试剂 | 第86页 |
| ·实验方法 | 第86-87页 |
| ·细胞的培养、转染 | 第86页 |
| ·稳定细胞株的构建方法 | 第86-87页 |
| ·促通读药物对无义mRNA水平的影响 | 第87页 |
| ·结果与讨论 | 第87-90页 |
| ·稳定细胞株的建立 | 第87-89页 |
| ·促通读药物PTC124处理细胞后Norm mRNA水平的变化 | 第89-90页 |
| ·促通读药物G418处理细胞后Norm mRNA水平的变化 | 第90页 |
| ·小结 | 第90-92页 |
| 总结与展望 | 第92-96页 |
| 参考文献 | 第96-112页 |
| 附录1 略语表 | 第112-114页 |
| 附录2 主要试剂配制 | 第114-116页 |
| 附录3 寡核苷酸序列 | 第116-119页 |
| 附录4 主要仪器设备 | 第119-120页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第120-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 个人简况及联系方式 | 第123-125页 |
