| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 缩略语表 | 第9-10页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-16页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征 | 第10-11页 |
| ·PRRS发现和对养殖业的危害 | 第10页 |
| ·PRRSV分子生物学特征 | 第10-11页 |
| ·PRRS治疗和预防情况 | 第11页 |
| ·miRNA的研究方法 | 第11-13页 |
| ·miRNA的发现 | 第11-12页 |
| ·miRNA成熟和作用原理 | 第12-13页 |
| ·miRNA的应用 | 第13-16页 |
| ·miRNA的临床应用 | 第13-14页 |
| ·miRNA与病毒 | 第14-16页 |
| 第2章 研究目的与意义 | 第16-17页 |
| 第3章 材料与方法 | 第17-30页 |
| ·材料 | 第17-21页 |
| ·主要菌株、毒株和细胞 | 第17页 |
| ·载体与质粒 | 第17页 |
| ·主要试剂购置 | 第17-18页 |
| ·培养基、抗生素配制 | 第18-19页 |
| ·缓冲液及其他使用溶液 | 第19-20页 |
| ·引物 | 第20-21页 |
| ·实验方法 | 第21-30页 |
| ·猪肺泡巨噬细胞(PAM)的分离和培养条件的优化 | 第21页 |
| ·Marc-145和PAM细胞总RNA的提取 | 第21-22页 |
| ·RT-PCR扩增PRRSV 3'UTR | 第22-23页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第23页 |
| ·酶切反应及酶切产物回收 | 第23页 |
| ·目的片段与载体质粒的连接 | 第23页 |
| ·DH5α感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| ·连接产物的转化 | 第24页 |
| ·质粒的小量制备 | 第24-25页 |
| ·质粒的大量制备 | 第25页 |
| ·脂质体介导转化法 | 第25页 |
| ·miRNA同源性的比较和PRRSV基因组编码miRNA的预测 | 第25页 |
| ·Real-time PCR检测基因的表达 | 第25-27页 |
| ·小分子RNA转染原代细胞(PAM) | 第27页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测PRRSV ORF7基因的表达 | 第27页 |
| ·Marc-145细胞感染PRRSV的噬斑实验 | 第27-28页 |
| ·PRRSV Nsp2蛋白表达的Western-blot检测 | 第28-29页 |
| ·miRNA靶基因的预测和筛选 | 第29-30页 |
| 第4章 结果与分析 | 第30-45页 |
| ·miRNA的筛选以及在Marc-145细胞感染PRRSV后的表达 | 第30-31页 |
| ·miRNA的筛选 | 第30页 |
| ·选取miRNA在Marc-145细胞中的表达 | 第30-31页 |
| ·PRRSV 3'UTR的克隆和质粒的大量制备 | 第31-32页 |
| ·PRRSV 3'UTR的克隆 | 第31-32页 |
| ·PRRSV 3'UTR克隆质粒的大量制备和检测 | 第32页 |
| ·miRNA转染Marc-145,PAM后对PRRSV增殖的影响 | 第32-35页 |
| ·绝对定量检测miRNA对PRRSV增殖的影响 | 第32-33页 |
| ·噬斑验证miRNA对PRRSV增殖的影响 | 第33-35页 |
| ·miR-125b对PRRSV增殖的影响 | 第35-39页 |
| ·Marc-145感染PRRSV后,miR-125b的表达 | 第35-36页 |
| ·miR-125b模拟物和抑制剂转染Marc-145,miR-125b的表达 | 第36-37页 |
| ·噬斑检测不同剂量miR-125b对PRRSV增殖的影响 | 第37页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测不同剂量miR-125b对PRRSV增殖的影响 | 第37-38页 |
| ·Western-blot验证不同剂量miR-125b对PRRSV Nsp2蛋白的影响 | 第38-39页 |
| · | 第39-40页 |
| ·Target Scan网站预测miR-125b的靶基因 | 第39页 |
| ·miR-125b对PRRSV 3'UTR的影响 | 第39-40页 |
| ·miR-125b对NF-κB的影响 | 第40-41页 |
| ·miR-125b对κB-RAS2的影响 | 第40页 |
| ·不同剂量miR-125b对NF-κB表达的影响 | 第40-41页 |
| ·NF-κB表达对PRRSV增殖的影响 | 第41-44页 |
| ·BAY11-7082对PRRSV增殖的影响 | 第41-43页 |
| ·p65瞬时转染对PRRSV增殖的影响 | 第43-44页 |
| ·PRRSV激活NF-κB的表达 | 第44页 |
| ·miR-125b通过抑制NF-κB信号通路抑制PRRSV的复制 | 第44-45页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第45-47页 |
| ·讨论 | 第45-46页 |
| ·合成miRNA质量的鉴定和效果的稳定性 | 第45页 |
| ·在Marc-145细胞中PRRSV增殖抑制miR-125b和激活NF-κB表达时间依赖 | 第45页 |
| ·在Marc-145、PAM细胞中验证miR-125b抑制PRRSV增殖 | 第45-46页 |
| ·miRNA抑制NF-κB表达的意义 | 第46页 |
| ·结论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 致谢 | 第51页 |
