| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-13页 |
| 英文缩略词表 | 第13-15页 |
| 前言 | 第15-19页 |
| 实验材料 | 第19-25页 |
| 1 细胞系 | 第19页 |
| 2 药品与试剂 | 第19-21页 |
| ·主要药品 | 第19页 |
| ·细胞培养相关 | 第19页 |
| ·细胞增殖相关 | 第19页 |
| ·细胞凋亡检测相关 | 第19-20页 |
| ·细胞转染和荧光染色用液 | 第20页 |
| ·透射电镜相关 | 第20页 |
| ·Western Blot相关 | 第20-21页 |
| 2 主要仪器 | 第21-22页 |
| 3 常用溶液的配制 | 第22-25页 |
| ·细胞培养用液 | 第22页 |
| ·电镜用液 | 第22-23页 |
| ·细胞实验用液 | 第23页 |
| ·Western Bbt实验用液 | 第23-25页 |
| 实验方法 | 第25-36页 |
| 1 细胞复苏、培养、传代及冻存 | 第25-26页 |
| ·细胞的复苏 | 第25页 |
| ·细胞的培养与传代 | 第25-26页 |
| ·细胞的冻存 | 第26页 |
| 2 SRB法测细胞增殖 | 第26-27页 |
| 3 细胞凋亡检测实验 | 第27-28页 |
| ·AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术 | 第27-28页 |
| 4 细胞自噬检测实验 | 第28-29页 |
| ·western blot检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ,Beclin1 | 第28页 |
| ·透射电子显微镜法观察自噬体、自噬溶酶体超微结构 | 第28页 |
| ·EGFP-LC3质粒转染结合共聚焦显微镜 | 第28-29页 |
| ·质粒转化 | 第28页 |
| ·质粒扩增 | 第28-29页 |
| ·质粒提取 | 第29页 |
| ·质粒转染 | 第29页 |
| ·共聚焦显微镜观察 | 第29页 |
| 5 CAI对A549细胞的autophagic influx的影响 | 第29-31页 |
| ·溶酶体蛋白酶抑制剂E64d、PepstatinA存在下CAI对LC3-Ⅱ的影响 | 第29-30页 |
| ·MDC染色结合共聚焦显微镜观察自噬溶酶体 | 第30-31页 |
| ·MDC染色结合流式细胞术半定量分析自噬溶酶体增强比率 | 第31页 |
| 6 溶酶体实验：CAI对A549细胞溶酶体的影响 | 第31-32页 |
| ·透射电子显微镜法 | 第31页 |
| ·油红O染色法 | 第31-32页 |
| 7 western blot检测信号通路相关蛋白 | 第32-35页 |
| ·细胞中总蛋白的提取 | 第32页 |
| ·蛋白定量(BCA法) | 第32-33页 |
| ·上样样品制备 | 第33页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第33-34页 |
| ·转膜 | 第34页 |
| ·封闭和抗体孵育 | 第34页 |
| ·发光显影-增强化学发光法(ECL) | 第34-35页 |
| 8 统计学分析 | 第35-36页 |
| 实验结果 | 第36-63页 |
| 第一部分：CAI对自噬的调节作用 | 第36-54页 |
| 1 CAI剂量依赖性和时间依赖性地抑制A549细胞增殖 | 第36-37页 |
| 2 CAI诱导A549细胞凋亡的作用 | 第37-38页 |
| 3 CAI促进A549细胞自噬泡 | 第38-42页 |
| ·CAI升高自噬相关蛋白LC3-Ⅱ蛋白表达水平 | 第38-39页 |
| ·EGFP-LC3绿色荧光亮点形成实验评价自噬体数目 | 第39-40页 |
| ·电子显微镜法观察A549细胞自噬泡超微形态结构 | 第40-42页 |
| 4 CAI阻断A549细胞自噬溶酶体降解 | 第42-43页 |
| ·胃酶抑素A预孵育1h,观察CAI给药后LC3-Ⅱ蛋白表达的变化 | 第42-43页 |
| ·PepstatinA/E64d共孵育,观察CAI给药后LC3-Ⅱ蛋白表达的变化 | 第43页 |
| 5 CAI增加A549细胞中的酸性自噬溶酶体数目 | 第43-46页 |
| 6 CAI增加A549细胞中初级溶酶体数目 | 第46-49页 |
| 7 自噬溶酶体的增多发生在增殖抑制作用之前 | 第49-51页 |
| 8 CAI合用rapamycin增强对A549细胞增殖抑制,具有协同作用 | 第51-52页 |
| 小结 | 第52页 |
| 9 CAI引起A549细胞线粒体损伤 | 第52-54页 |
| 第二部分：CAI对自噬调节的分子机制 | 第54-57页 |
| 1 CAI调节A549细胞自噬的相关分子机制 | 第54-57页 |
| ·CAI作用A549细胞24h,降低mTOR磷酸化水平 | 第54-56页 |
| ·CAI20μM作用A549细胞随时间变化升高p53、降低SIRT1蛋白表达 | 第56-57页 |
| 第三部分：CAI对自噬和凋亡的平衡调节(和3-MA合用) | 第57-63页 |
| 1 CAI和3-MA合用抑制细胞自噬 | 第57-58页 |
| ·CAI和3-MA(1.25mM)合用48h,剂量依赖性地下调自噬水平 | 第57-58页 |
| ·CAI与3-MA(5mM)合用24h降低LC3-Ⅱ蛋白表达水平 | 第58页 |
| 2 CAI合用3-MA对A549细胞增殖的影响及合用指数分析 | 第58-61页 |
| ·CAI合用3-MA(1.25mM)对A549细胞增殖的影响及合用指数分析 | 第58-60页 |
| ·CAI/3-MA(5mM)合用组和CAI单用组作用24h降低A549细胞存活率没有差异 | 第60-61页 |
| 3 CAI和3-MA合用对A549细胞凋亡的影响 | 第61-63页 |
| 实验讨论 | 第63-75页 |
| 1. CAI作为Ca~(2+)内流抑制剂的研究回溯 | 第63-64页 |
| 2. 细胞凋亡不是CAI消除肿瘤细胞的唯一机制 | 第64-65页 |
| 3. 自噬信号传导调节机制 | 第65-69页 |
| ·mTOR依赖的信号通路 | 第66-68页 |
| ·非mTOR依赖的信号通路 | 第68-69页 |
| 4. 溶酶体蛋白酶是连接自噬与肿瘤、炎症的桥梁之一 | 第69-71页 |
| ·Cathepsin B是一个重要的抗癌靶点 | 第69-70页 |
| ·关于溶酶体需进一步解决的问题 | 第70-71页 |
| 5. SIRT1和CAI的抗炎、抗肿瘤活性的关联 | 第71-72页 |
| 6. 细胞自噬的生理意义 | 第72页 |
| 7. 自噬机理对于整合CAI的抗肿瘤抗炎效果胞内信号具有重要意义 | 第72-75页 |
| 实验结论 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
