| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-44页 |
| ·细胞色素P450研究进展 | 第14-19页 |
| ·细胞色素P450概述 | 第14-15页 |
| ·细胞色素P450多样性 | 第15-17页 |
| ·真菌细胞色素P450研究概况 | 第17-19页 |
| ·CYP51——甾醇14α-去甲基化酶 | 第19-30页 |
| ·CYP51家族研究概况 | 第19-20页 |
| ·CYP51的功能及调节作用 | 第20-24页 |
| ·CYP51活性分析 | 第24-26页 |
| ·CYP51结构解析 | 第26-30页 |
| ·抗真菌剂研究进展 | 第30-39页 |
| ·抗真菌剂种类及其作用机制 | 第30-31页 |
| ·病原真菌对SBIs杀菌剂的抗性机理 | 第31-35页 |
| ·氮唑类杀真菌剂研究进展 | 第35-38页 |
| ·DMIs药物作用靶标酶CYP51的方法学研究 | 第38-39页 |
| ·细胞色素P450基因的异源表达 | 第39-42页 |
| ·立题依据及研究意义 | 第42-44页 |
| 第二章 柑桔绿霉菌CYP51克隆表达和多克隆抗体的制备 | 第44-63页 |
| ·引言 | 第44-45页 |
| ·实验材料 | 第45-47页 |
| ·菌种和质粒 | 第45页 |
| ·化学试剂和抗菌素 | 第45页 |
| ·工具酶 | 第45页 |
| ·常用储存液 | 第45页 |
| ·常用缓冲液 | 第45-46页 |
| ·Ni-NTA亲和层析用缓冲液 | 第46页 |
| ·ELISA用缓冲液 | 第46-47页 |
| ·Western blot用缓冲液 | 第47页 |
| ·Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱 | 第47页 |
| ·常用培养基 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-54页 |
| ·真菌DNA的提——CTAB法 | 第47-48页 |
| ·真菌RNA的提取——Trizol法 | 第48页 |
| ·柑桔绿霉菌CYP51基因特异性引物的设计 | 第48页 |
| ·RT-PCR | 第48-49页 |
| ·基因序列分析 | 第49页 |
| ·重组载体构建 | 第49-51页 |
| ·重组蛋白的原核表达 | 第51页 |
| ·Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质 | 第51-52页 |
| ·重组蛋白的透析、浓缩和定量 | 第52页 |
| ·多克隆抗体的制备及效价测定 | 第52-53页 |
| ·Western blot分析 | 第53-54页 |
| ·结果与分析 | 第54-62页 |
| ·柑桔绿霉菌PdCYP51基因克隆 | 第54-55页 |
| ·柑桔绿霉菌CYP51 cDNA测序分析 | 第55-56页 |
| ·PdCYP51基因分析 | 第56-59页 |
| ·重组表达质粒pET-PdCYP51的构建及在大肠杆菌中的表达 | 第59-60页 |
| ·重组柑桔绿霉菌CYP51蛋白的分离纯化 | 第60-61页 |
| ·多克隆抗体的制备和免疫学活性鉴定 | 第61-62页 |
| ·讨论 | 第62-63页 |
| 第三章 PdCYP51结构分析、突变体构建及表达条件的优化 | 第63-84页 |
| ·引言 | 第63-64页 |
| ·实验材料 | 第64-65页 |
| ·实验方法 | 第65-67页 |
| ·柑桔绿霉菌CYP51突变体特异性引物的设计 | 第65页 |
| ·PCR | 第65页 |
| ·基因序列分析 | 第65页 |
| ·同源模建 | 第65页 |
| ·重组载体构建 | 第65-66页 |
| ·重组蛋白原核表达条件的优化 | 第66页 |
| ·Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白质 | 第66页 |
| ·重组蛋白的透析、浓缩和定量 | 第66页 |
| ·酵母转化 | 第66-67页 |
| ·结果与分析 | 第67-82页 |
| ·PdCYP51蛋白疏水性分析 | 第67页 |
| ·PdCYP51蛋白结构预测 | 第67-69页 |
| ·重组表达质粒pET-PdCYP512表达条件的优化和纯化 | 第69-73页 |
| ·PdCYP51跨膜结构分析 | 第73-74页 |
| ·PdCYP51突变体的同源模建 | 第74页 |
| ·PdCYP51-18突变体的构建及表达 | 第74-76页 |
| ·PdCYP51-66和PdCYP51-244突变体的构建及表达 | 第76-79页 |
| ·PdCYP51酵母表达载体的构建及转化 | 第79-82页 |
| ·讨论 | 第82-84页 |
| 第四章 DMIs杀菌剂活性筛选方法的建立、应用及分子对接 | 第84-108页 |
| ·引言 | 第84-85页 |
| ·材料和方法 | 第85-88页 |
| ·实验材料 | 第85页 |
| ·药物对柑桔绿霉菌生长抑制的测试 | 第85-86页 |
| ·柑桔绿霉菌微粒体的制备 | 第86页 |
| ·PdCYP51重组蛋白的制备和蛋白浓度测定 | 第86页 |
| ·重组蛋白PdCYP51含量测定及活性测定(CO差光谱) | 第86-87页 |
| ·药物和靶标酶结合光谱分析 | 第87页 |
| ·分子对接模型的建立 | 第87-88页 |
| ·结果与分析 | 第88-106页 |
| ·杀真菌剂对柑桔绿霉菌生长抑制作用 | 第88页 |
| ·重组蛋白PdCYP51及突变体的性质研究 | 第88-89页 |
| ·PdCYP51蛋白结合光谱的建立 | 第89-92页 |
| ·标准杀真菌剂的光谱分析结果及与抑制率的相关性 | 第92-94页 |
| ·分子对接 | 第94-95页 |
| ·结合光谱法在筛选新农药中的应用 | 第95-106页 |
| ·讨论 | 第106-108页 |
| 第五章 结论 | 第108-111页 |
| 参考文献 | 第111-126页 |
| 附录1 XF系列化合物与PdCYP51-18结合光谱 | 第126-131页 |
| 附录2 WJ系列化合物与PdCYP51结合光谱 | 第131-138页 |
| 附录3 ZST系列化合物与PdCYP51结合光谱 | 第138-142页 |
| 缩略表 | 第142-143页 |
| 博士期间发表和待发表论文 | 第143-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
