| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-40页 |
| 第一章 鸡白细胞介素2的分子生物学研究进展 | 第15-22页 |
| 1 ChIL-2体外诱导及克隆 | 第15页 |
| 2 ChIL-2表达 | 第15-17页 |
| 3 ChIL-2结构特征 | 第17页 |
| 4 ChIL-2结构与功能的关系 | 第17-18页 |
| 5 ChIL-2种属特异性 | 第18-19页 |
| 6 ChIL-2活性检测 | 第19-20页 |
| 参考文献 | 第20-22页 |
| 第二章 IL-2作为免疫佐剂的研究进展 | 第22-31页 |
| 1 IL-2作为DNA疫苗的免疫佐剂 | 第22-26页 |
| ·哺乳动物IL-2作为DNA疫苗免疫佐剂 | 第23-25页 |
| ·鸡IL-2作为DNA疫苗的免疫佐剂 | 第25-26页 |
| 2 哺乳动物IL-2作为免疫佐剂的研究进展 | 第26页 |
| ·人IL-2 | 第26页 |
| ·牛IL-2 | 第26页 |
| ·猪IL-2 | 第26页 |
| 3 禽类IL-2作为免疫佐剂的应用进展 | 第26-28页 |
| 参考文献 | 第28-31页 |
| 第三章 基因转移载体在体内分布的研究进展 | 第31-40页 |
| 1 引物设计 | 第31页 |
| 2 组织样品的采集 | 第31-32页 |
| 3 动物试验设计 | 第32页 |
| 4 放射性标记载体的分布 | 第32-33页 |
| 5 基因转移载体家族的生物分布 | 第33-37页 |
| ·腺病毒载体 | 第33-34页 |
| ·Ⅱ型腺相关病毒(AAV2)载体的体内分布研究 | 第34-35页 |
| ·质粒DNA载体 | 第35-37页 |
| ·源于Ⅰ型和Ⅱ型疱疹病毒载体 | 第37页 |
| 6 小结 | 第37-38页 |
| 参考文献 | 第38-40页 |
| 第二部分 研究内容 | 第40-86页 |
| 第四章 重组鸡白细胞介素2质粒(pCI-ChIL-2-EGFP)的构建及表达 | 第41-58页 |
| 1 材料 | 第41-42页 |
| ·基因工程载体、菌株和细胞株 | 第41页 |
| ·实验动物 | 第41页 |
| ·分子生物学试剂 | 第41-42页 |
| ·主要仪器 | 第42页 |
| 2 方法 | 第42-51页 |
| ·真核表达载体pCI-ChIL-2-EGFP的构建 | 第42-47页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP的构建过程 | 第42页 |
| ·PCR引物设计 | 第42-43页 |
| ·PCR扩增ChIL-2 | 第43-44页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第44页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| ·pCI-ChIL-2的构建 | 第45-46页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP质粒的构建 | 第46-47页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP体外表达 | 第47-49页 |
| ·转染级超纯度真核表达质粒的制备 | 第47页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP在Vero细胞中的表达 | 第47-48页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP在CEF细胞中的表达 | 第48页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP在外周血淋巴细胞(PBLC)中的表达 | 第48-49页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP体内表达 | 第49-51页 |
| ·真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP的大量制备 | 第49页 |
| ·动物接种 | 第49页 |
| ·RT-PCR | 第49-51页 |
| ·荧光显微镜观察肌肉注射部位融合蛋白的表达 | 第51页 |
| ·ELISA法检测ChIL-2-EGFP融合蛋白的产生 | 第51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-54页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP重组体的鉴定 | 第51-52页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP重组质粒的体外表达 | 第52页 |
| ·pCI-ChIL-2-EGFP重组质粒的体内表达 | 第52-54页 |
| ·体内EGFP的RNA水平的表达 | 第52-53页 |
| ·荧光显微镜观察融合蛋白的表达 | 第53-54页 |
| ·ELISA结果 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-58页 |
| 第五章 重组鸡白细胞介素2质粒(pCI-ChIL-2)在体内的分布研究 | 第58-68页 |
| 1 材料 | 第58-59页 |
| ·质粒 | 第58-59页 |
| ·主要分子生物学试剂 | 第59页 |
| ·主要仪器 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-62页 |
| ·本研究所用引物 | 第59页 |
| ·质粒DNA制备 | 第59页 |
| ·动物试验 | 第59-60页 |
| ·样品采集 | 第60页 |
| ·pCI-ChIL-2的体内分布 | 第60页 |
| ·竞争PCR中竞争体的构建 | 第60-62页 |
| ·竞争PCR定量血清中不同时间段的pCI-ChIL-2质粒 | 第62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-65页 |
| ·竞争体的构建结果 | 第62-63页 |
| ·pCI-ChIL-2在血液和组织器官中的分布 | 第63-64页 |
| ·竞争PCR | 第64-65页 |
| 3 讨论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-68页 |
| 第六章 重组鸡白细胞介素2质粒(pCI-ChIL-2)对H5亚型AIV疫苗免疫增强作用研究 | 第68-75页 |
| 1 材料与方法 | 第69-70页 |
| ·禽流感(AIV)疫苗 | 第69页 |
| ·重组IL-2质粒及IL-2蛋白 | 第69页 |
| ·试验鸡分组及免疫 | 第69页 |
| ·T淋巴细胞增殖试验 | 第69-70页 |
| ·HI抗体消长水平监测 | 第70页 |
| ·数据处理和分析 | 第70页 |
| 2 结果 | 第70-72页 |
| ·外周血T淋巴细胞增殖试验结果 | 第70-71页 |
| ·pCI-ChIL-2对AIV疫苗免疫协同对机体HI抗体水平的消长影响 | 第71-72页 |
| 3 讨论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-75页 |
| 第七章 pCI-ChIL-2的转基因生物安全试验 | 第75-85页 |
| 1 中间试验 | 第75-77页 |
| ·材料与方法 | 第75-76页 |
| ·试验鸡 | 第75页 |
| ·真核质粒pCI-ChIL-2的大量制备 | 第75页 |
| ·重组质粒在注射局部的残留时间及在各脏器的分布 | 第75-76页 |
| ·监测重组质粒在动物粪便中的存活情况 | 第76页 |
| ·监测重组质粒在环境微生物中的存活情况 | 第76页 |
| ·监测环境微生物中氨苄青霉素的抗性发生情况 | 第76页 |
| ·结果 | 第76-77页 |
| ·重组质粒在注射局部的残留时间及在各脏器的分布 | 第76页 |
| ·重组质粒在动物粪便中的存活情况 | 第76页 |
| ·重组质粒在环境微生物中的存活情况 | 第76-77页 |
| ·环境微生物中氨苄青霉素的抗性发生情况 | 第77页 |
| 2 环境释放试验 | 第77-78页 |
| ·材料与方法 | 第77-78页 |
| ·试验鸡 | 第77页 |
| ·真核质粒pCI-ChIL-2的大量制备 | 第77页 |
| ·进一步明确pCI-ChIL-2免疫鸡后在体内的最长残留时间 | 第77页 |
| ·进一步检测重组质粒在动物排泄物中残存情况 | 第77页 |
| ·进一步监测环境微生物中氨苄青霉素的抗性发生情况 | 第77-78页 |
| ·pCI-ChIL-2的临床试验 | 第78页 |
| ·结果 | 第78页 |
| ·pCI-ChIL-2免疫鸡后在体内的最长残留时间 | 第78页 |
| ·重组质粒在动物排泄物中残存情况 | 第78页 |
| ·环境微生物中氨苄青霉素的抗性发生情况 | 第78页 |
| ·临床试验结果 | 第78页 |
| 3 生产性试验 | 第78-83页 |
| ·材料与方法 | 第78-80页 |
| ·试验鸡 | 第78页 |
| ·检测用标准抗原 | 第78页 |
| ·真核质粒pCI-ChIL-2和pEGFP-N1的大量制备 | 第78-79页 |
| ·大量制备的pEGFP-N1质粒转染成骨细胞 | 第79页 |
| ·检测pEGFP-N1的转染效果 | 第79页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2免疫增强剂的制备 | 第79页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2对禽流感疫苗的免疫增强作用 | 第79页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2对新城疫疫苗的免疫增强作用 | 第79-80页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2对传染性法氏囊病毒疫苗的免疫增强作用 | 第80页 |
| ·观察免疫鸡的临床反应 | 第80页 |
| ·监测试验鸡舍中环境微生物pCI-IL-2抗性基因转移情况 | 第80页 |
| ·结果 | 第80-83页 |
| ·大抽质粒转染细胞的效率 | 第80-81页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2对禽流感疫苗的免疫增强作用 | 第81页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2对鸡新城疫疫苗的免疫增强作用 | 第81-82页 |
| ·重组质粒pCI-ChIL-2对传染性法氏囊病疫苗的免疫增强作用 | 第82-83页 |
| ·试验鸡的临床观察 | 第83页 |
| ·环境微生物的pCI-IL-2抗性基因转移情况 | 第83页 |
| 4 小结 | 第83-85页 |
| 总结 | 第85-86页 |
| 第三部分 附录 | 第86-93页 |
| 附录1 常用试剂及缓冲液 | 第87-91页 |
| 附录2 攻读硕士期间参与的课题 | 第91页 |
| 附录3 攻读硕士期间发表的论文 | 第91-92页 |
| 附录4 pCI-ChIL-2在浙江省生产应用的安全证书 | 第92-93页 |
| 附录5 致谢 | 第93页 |
