| Ⅰ 前言 | 第1-14页 |
| Ⅱ 综述 | 第14-29页 |
| 1 转基因抗除草剂作物的必要性及优越性 | 第14-15页 |
| 2 抗除草剂基因工程在作物品种选育中的应用研究进展 | 第15-18页 |
| 2．1 国外作物抗除草剂基因工程研究进展 | 第15-16页 |
| 2．2 我国转基因抗除草剂作物品种选育的研究进展 | 第16-17页 |
| 2．3 转基因作物的种植情况 | 第17-18页 |
| 3 抗除草剂基因在植物遗传育种中的应用研究 | 第18-20页 |
| 3．1 利用抗除草剂基因作为遗传转化的筛选标记基因 | 第18页 |
| 3．2 培育抗除草剂转基因作物 | 第18-19页 |
| 3．3 抗除草剂基因在杂交优势利用中应用研究 | 第19-20页 |
| 4 基因工程方法培育抗除草剂作物品种的技术策略 | 第20-23页 |
| 4．1 产生过量的靶标酶或靶标蛋白质 | 第20-21页 |
| 4．2 产生除草剂原靶标的异构酶或异构蛋白质，使其对除草剂不敏感 | 第21页 |
| 4．3 产生能修饰除草剂的酶或酶系统 | 第21-23页 |
| 4．4 对除草剂解毒能力的提高 | 第23页 |
| 4．5 对除草剂的屏蔽作用或作用位点的隔离作用 | 第23页 |
| 5 转基因抗除草剂的遗传转化方法及其特点 | 第23-25页 |
| 5．1 农杆菌介导法 | 第23-24页 |
| 5．2 基因枪介导的转化方法 | 第24页 |
| 5．3 电穿孔法 | 第24-25页 |
| 5．4 PEG介导法 | 第25页 |
| 6 抗除草剂基因工程应注意的问题 | 第25页 |
| 7 基因工程在油菜育种中的应用 | 第25-29页 |
| 7．1 抗除草剂基因工程在油菜中的应用 | 第26页 |
| 7．2 基因工程在油菜抗病育种中的应用 | 第26-27页 |
| 7．3 基因工程在油菜品质改良中的应用 | 第27页 |
| 7．4 基因工程在油菜杂种优势利用中的应用 | 第27-28页 |
| 7．5 利用油菜作为生物反应器 | 第28-29页 |
| Ⅲ 研究目标、基本思路和技术路线 | 第29-30页 |
| Ⅳ 实验部分 | 第30-78页 |
| 一、RBCS启动子的克隆及活性鉴定 | 第30-43页 |
| 1 材料和方法 | 第30-39页 |
| 1．1 主要仪器和试剂 | 第30页 |
| 1．2 菌株、质粒和植物材料 | 第30-31页 |
| 1．3 引物设计 | 第31页 |
| 1．4 启动子基因片段的PCR扩增 | 第31-37页 |
| 1．4．1 豌豆基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| 1．4．2 rbcS启动子基因PCR扩增体系 | 第32页 |
| 1．4．3 PCR产物的凝胶电泳观察 | 第32-33页 |
| 1．4．4 目的片段的回收 | 第33页 |
| 1．4．5 目的片段与T-vector连接及导入宿主菌 | 第33-35页 |
| 1．4．6 重组子的筛选与鉴定 | 第35-37页 |
| 1．5 RBCS启动子驱动的GFP基因植物表达载体构建 | 第37-38页 |
| 1．6 基因枪转化 | 第38-39页 |
| 1．6．1 钨粉及微弹DNA的制备 | 第38页 |
| 1．6．2 基因枪操作 | 第38-39页 |
| 1．7 RBCS活性分析 | 第39页 |
| 2 结果分析 | 第39-42页 |
| 2．1 RBCS启动子的克隆及序列分析 | 第39-41页 |
| 2．2 RBCS基因启动子的活性鉴定 | 第41-42页 |
| 2．2．1 表达载体pBIRB-GFP的构建 | 第41页 |
| 2．2．2 GFP基因表达的检测 | 第41-42页 |
| 3 讨论 | 第42-43页 |
| 3．1 关于引物设计中酶切位点的利用 | 第42页 |
| 3．2 关于启动子活性鉴定方法 | 第42-43页 |
| 3．3 关于RSCS基因启动子的特征和功能 | 第43页 |
| 二、BAR、BXN基因的克隆、定点突变及在微生物中的表达 | 第43-59页 |
| 1．材料和方法 | 第43-50页 |
| 1．1 主要仪器和试剂 | 第43-44页 |
| 1．2 菌株、质粒和植物材料 | 第44页 |
| 1．3 引物设计 | 第44页 |
| 1．4 目的片段的PCR扩增 | 第44-47页 |
| 1．4．1 bxn基因PCR扩增及序列分析 | 第44-46页 |
| 1．4．1．1 菌种的恢复培养 | 第44-45页 |
| 1．4．1．2 细菌基因组DNA提取 | 第45-46页 |
| 1．4．1．3 bxn基因PCR扩增体系 | 第46页 |
| 1．4．1．4 bxn基因的克隆、重组子的筛选及检测 | 第46页 |
| 1．4．2 bar基因的亚克隆及序列分析 | 第46-47页 |
| 1．4．2．1 bar基因PCR扩增体系 | 第46-47页 |
| 1．4．2．2 bar基因的克隆、重组子的筛选及鉴定 | 第47页 |
| 1．5 BAR、BXN基因在微生物中的表达 | 第47-50页 |
| 1．5．1 目的基因的诱导表达 | 第47-48页 |
| 1．5．2 SDS-PAGE电泳 | 第48-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-57页 |
| 2．1 BAR、BXN基因PCR扩增及序列分析 | 第50-54页 |
| 2．1．1 细菌核基因组DNA的提取 | 第50页 |
| 2．1．2 目的片段的PCR扩增 | 第50页 |
| 2．1．3 克隆、阳性重组子的筛选 | 第50-52页 |
| 2．1．4 核苷酸序列分析 | 第52-54页 |
| 2．1．5 bxn基因的PCR定点突变 | 第54页 |
| 2．2 BAR、BXN基因在原核细胞中的表达 | 第54-57页 |
| 2．2．1 bar、bxn基因的原核表达载体构建 | 第54-55页 |
| 2．2．2 bar、bxn基因在原核表达载体的鉴定 | 第55-56页 |
| 2．2．3 目的基因在E.coli BL21中的诱导表达 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-59页 |
| 3．1 关于细菌基因组DNA的提取 | 第57页 |
| 3．1．1 菌种活化 | 第57页 |
| 3．1．2 细菌基因组DNA的提取 | 第57页 |
| 3．2 关于基因的定点突变 | 第57-58页 |
| 3．3 关于原核表达异源基因的方法 | 第58-59页 |
| 三、植物表达载体的构建 | 第59-70页 |
| 1 材料和方法 | 第59-64页 |
| 1．1 主要仪器和试剂 | 第59页 |
| 1．2 菌株、质粒和植物材料 | 第59页 |
| 1．3 植物表达载体的改造 | 第59-61页 |
| 1．3．1 pBI121表达载体的改造 | 第59-60页 |
| 1．3．1．1 引物设计 | 第59页 |
| 1．3．1．2 NOS终止序列的克隆 | 第59-60页 |
| 1．3．1．2．1 植物表达载体质粒DNA的提取方法 | 第59-60页 |
| 1．3．1．2．2 NOS终止序列的PCR扩增 | 第60页 |
| 1．3．1．2．3 目的片段的回收、连接及向宿主细胞的导入 | 第60页 |
| 1．3．1．2．4 重组子的筛选与鉴定 | 第60页 |
| 1．3．2 pCR1300表达载体的改造 | 第60-61页 |
| 1．4 BAR、BXN基因植物表达载体的构建 | 第61-62页 |
| 1．4．1 质粒提取 | 第61页 |
| 1．4．2 pBA-T、pBX-T、pRB-T、pBI121和pCR1300质粒的酶切和目的片段的回收 | 第61-62页 |
| 1．4．3 目的基因与载体分子的连接 | 第62页 |
| 1．4．4 表达载体酶切鉴定 | 第62页 |
| 1．5 BAR、BXN基因双价植物表达载体的构建 | 第62-64页 |
| 1．5．1 pBIBAH和pCRBN质粒的提取 | 第62页 |
| 1．5．2 pBIBAH和pCRBN质粒的酶切及目的片段回收 | 第62-63页 |
| 1．5．3 目的片段的连接 | 第63页 |
| 1．5．4 表达载体酶切鉴定 | 第63-64页 |
| 2 结果分析 | 第64-69页 |
| 2．1 植物表达载体的改造 | 第64-66页 |
| 2．1．1 pBI121表达载体的改造 | 第64-65页 |
| 2．1．1．1 NOS-ter终止序列的克隆及序列分析 | 第64-65页 |
| 2．1．1．2 克隆的加有新酶切位点的终止子NOS-ter片段与植物表达载体的连接及转化 | 第65页 |
| 2．1．2 pCR1300表达载体的改造 | 第65-66页 |
| 2．2 pBIBAH和pCRBN质粒的PCR扩增和酶切鉴定 | 第66页 |
| 2．3 BAR、BXN基因双价植物表达载体的构建 | 第66页 |
| 2．4 双价植物表达载体pBIBAH-CRBN检测 | 第66-69页 |
| 3 讨论 | 第69-70页 |
| 3．1 关于植物表达载体的构建 | 第69页 |
| 3．2 关于启动子的选择 | 第69-70页 |
| 四、油菜双价抭除草剂基因转化系统研究 | 第70-78页 |
| 1 材料与方法 | 第70-74页 |
| 1．1 试验材料及仪器 | 第70页 |
| 1．2 培养基 | 第70-71页 |
| 1．3 试验方法 | 第71-74页 |
| 1．3．1 基因枪转化油菜 | 第71-72页 |
| 1．3．1．1 质粒DNA的制备 | 第71页 |
| 1．3．1．2 受体材料的制备 | 第71页 |
| 1．3．1．3 钨粉及微弹DNA的制备 | 第71页 |
| 1．3．1．4 基因枪操作 | 第71页 |
| 1．3．1．5 轰击后受体材料的培养 | 第71-72页 |
| 1．3．1．5．1 过渡培养 | 第71页 |
| 1．3．1．5．2 转化植株的获得 | 第71-72页 |
| 1．3．2 农杆菌工程菌的获得 | 第72-74页 |
| 1．3．2．1 植物表达载体转化农杆菌 | 第72页 |
| 1．3．2．1．1 感受态农杆菌制备 | 第72页 |
| 1．3．2．1．2 pBIBAH-CRBN双价植物表达载体转化农杆菌 | 第72页 |
| 1．3．2．2 农杆菌整合外源基因的鉴定 | 第72-74页 |
| 1．3．2．2．1 农杆菌Ti质粒DNA碱法小量提取 | 第72-73页 |
| 1．3．2．2．2 农杆菌Ti质粒整合bar、bxn基因的PCR检测 | 第73-74页 |
| 1．3．3 农杆菌介导的pBIBAH-CRBN对油菜的遗传转化 | 第74页 |
| 1．3．3．1 子叶及子叶柄的浸染 | 第74页 |
| 1．3．3．2 转化植株的获得 | 第74页 |
| 2 结果与分析 | 第74-75页 |
| 2．1 农杆菌整合外源基因的PCR鉴定 | 第74页 |
| 2．2 油菜无菌受体材料的获得 | 第74-75页 |
| 2．3 高渗处理对油菜子叶及子叶柄再生与转化率的影响 | 第75页 |
| 2．4 农杆菌介导的PBIBAH-CRBN对油菜的遗传转化 | 第75页 |
| 3 讨论 | 第75-78页 |
| 3．1 关于遗传转化方法的比较 | 第75-76页 |
| 3．2 关于转化受体对油菜遗传转化的影响 | 第76页 |
| 3．3 激素配比及抗生素筛选浓度的确定 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
