| 摘要 | 第1-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-34页 |
| ·烟草基因工程技术发展简史 | 第16-22页 |
| ·转基因烟草的研究概况 | 第17-19页 |
| ·转基因烟草商业化的概况 | 第19-20页 |
| ·转基因烟草的检测 | 第20-21页 |
| ·转基因烟草安全性评价的研究概况 | 第21页 |
| ·转基因烟草的发展与应用前景 | 第21-22页 |
| ·烟草抗真菌病害基因工程研究 | 第22-32页 |
| ·烟草抗真菌病害防卫反应的研究 | 第23-25页 |
| ·增强细胞壁结构 | 第23页 |
| ·诱导产生或激活抗菌物质 | 第23-25页 |
| ·几丁质酶与β-1，3葡聚糖酶的研究与应用 | 第25-29页 |
| ·几丁质酶与β-1，3葡聚糖酶的作用原理 | 第25-26页 |
| ·几丁质酶的分子生化特性 | 第26页 |
| ·几丁质酶的分类 | 第26-27页 |
| ·几丁质酶的诱导表达特性 | 第27-28页 |
| ·几丁质酶与β-1，3葡聚糖酶的应用 | 第28-29页 |
| ·烟草抗毒素基因及其应用 | 第29-30页 |
| ·RIP基因及其应用 | 第30-31页 |
| ·过氧化物酶基因及其应用 | 第31页 |
| ·问题与展望 | 第31-32页 |
| ·立题依据与意义 | 第32-34页 |
| 引言 | 第34-35页 |
| 第二部分 几丁质酶基因的克隆与转化 | 第35-55页 |
| ·几丁质酶基因的克隆与转化 | 第35-50页 |
| ·试验材料来源 | 第35-36页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第36-37页 |
| ·电泳 | 第37页 |
| ·利用PCR扩增几丁质酶基因 | 第37-38页 |
| ·PCR产物的酶切与提纯 | 第38-39页 |
| ·载体质粒DNA的酶切 | 第39页 |
| ·酶切后的直链载体质粒(pROK_2)DNA去磷酸化 | 第39-40页 |
| ·DNA片段的连接 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制作 | 第41页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌 | 第41-42页 |
| ·含重组质粒的阳性菌落的检测 | 第42页 |
| ·酶切验证 | 第42页 |
| ·转化土壤农杆菌Agrobacteria tumefaciens LBA 4404 | 第42-44页 |
| ·转化 | 第43页 |
| ·验证 | 第43-44页 |
| ·烟草叶圆片的准备和转基因烟草的再生 | 第44-45页 |
| ·抗卡那霉素再生烟株的DNA分析 | 第45-46页 |
| ·SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot检测蛋白表达 | 第46-50页 |
| ·转基因烟草蛋白提取 | 第46-47页 |
| ·SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第47-49页 |
| ·Western Blot | 第49-50页 |
| ·结果 | 第50-51页 |
| ·克隆与转化 | 第50页 |
| ·转基因植株的再生 | 第50-51页 |
| ·PCR检测与蛋白表达检测 | 第51页 |
| ·讨论 | 第51-55页 |
| 第三部分 转基因植株几丁质酶活性检测与激光共聚焦显微镜观察所转外源基因在烟草组织中的表达位置研究 | 第55-60页 |
| ·材料与方法 | 第55-56页 |
| ·供试材料 | 第55页 |
| ·几丁质酶活性的测定 | 第55页 |
| ·用甲基乙丁烯酸包埋植物组织进行激光共聚焦显微镜观察 | 第55-56页 |
| ·切割与染色 | 第56页 |
| ·结果 | 第56-60页 |
| ·几丁质酶活性的测定和pH对几丁质酶活性的影响 | 第57页 |
| ·所转几丁质酶基因在植物组织中的表达位置 | 第57-60页 |
| 第四部分 转几丁质酶基因烟草植株对真菌病害的抗性研究 | 第60-68页 |
| ·对炭疽病的抗性鉴定 | 第60-63页 |
| ·材料与方法 | 第60-62页 |
| ·T_0转基因烟草植株的无性繁殖 | 第60-61页 |
| ·烟苗分段繁殖法 | 第61页 |
| ·腋芽繁殖法 | 第61页 |
| ·T_1、T_2、T_3转几丁质酶基因株系烟苗的准备 | 第61-62页 |
| ·接种物的准备 | 第62页 |
| ·接种方法 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-63页 |
| ·T_0转基因烟草植株对炭疽病的抗性鉴定结果 | 第62页 |
| ·T_1、T_2、T_3转几丁质酶基因株系对炭疽病的抗性鉴定结果 | 第62-63页 |
| ·对赤星病的抗性鉴定 | 第63-68页 |
| ·材料与方法 | 第63-65页 |
| ·接种体的准备 | 第63-64页 |
| ·接种方法 | 第64-65页 |
| ·赤星病的抗性鉴定结果 | 第65-66页 |
| ·讨论 | 第66-68页 |
| 第五部分 转基因烟草遗传稳定性研究 | 第68-72页 |
| ·材料和方法 | 第69页 |
| ·用含卡那霉素的培养基进行筛选鉴定 | 第69页 |
| ·T_2代转基因烟草的Western Blot分析 | 第69页 |
| ·结果 | 第69-71页 |
| ·卡那霉素筛选试验结果 | 第69页 |
| ·Western Blot结果 | 第69-71页 |
| ·讨论 | 第71-72页 |
| 第六部分 半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草成分的研究 | 第72-79页 |
| ·材料与方法 | 第73-75页 |
| ·植物材料 | 第73-74页 |
| ·半嵌套式PCR扩增 | 第74-75页 |
| ·半嵌套式PCR产物分析 | 第75页 |
| ·结果 | 第75-77页 |
| ·Western Blot结果 | 第75-76页 |
| ·PCR和半嵌套式PCR结果 | 第76-77页 |
| ·验证试验 | 第77页 |
| ·讨论 | 第77-79页 |
| 第七部分 转基因烟草在风媒条件下的基因漂移研究 | 第79-82页 |
| ·材料和方法 | 第79-80页 |
| ·结果 | 第80-82页 |
| 第八部分 转几丁质酶基因烟草对病毒和昆虫的抗性研究 | 第82-83页 |
| ·材料和方法 | 第82页 |
| ·结果 | 第82-83页 |
| 第九部分 结论与展望 | 第83-89页 |
| ·结论与讨论 | 第83-86页 |
| ·外源几丁质酶基因在烟草中表达与转基因烟草的几丁质酶活性研究 | 第83页 |
| ·转基因烟草对烟草真菌病害的抗性研究 | 第83-85页 |
| ·对炭疽病的抗性研究 | 第84页 |
| ·对赤星病的抗性研究 | 第84-85页 |
| ·外源基因在烟草组织中的表达部位研究 | 第85页 |
| ·外源基因在转基因烟草株系中的遗传稳定性 | 第85页 |
| ·转基因植株及其调制后烟叶转基因成分检测的新方法研究 | 第85-86页 |
| ·风媒可否导致转基因后代基因漂移的初步研究 | 第86页 |
| ·本论文的创新点 | 第86-87页 |
| ·问题与展望 | 第87-89页 |
| Abstract | 第89-91页 |
| Section 1: Cloning of Chitinase Sequence and Transformation | 第91-112页 |
| ·Material and Methods | 第93-111页 |
| ·Alkaline lysis purification for plasmid minipreps | 第93-94页 |
| ·Electrophoresis | 第94-95页 |
| ·Introducing a Restriction Enzyme Site by PCR | 第95-96页 |
| ·Materials Required for PCR | 第95-96页 |
| ·PCR Amplification | 第96页 |
| ·Digest PCR product and Purification | 第96-97页 |
| ·Verifying the PCR Products by using Hind Ⅲ | 第96-97页 |
| ·Using QIAquick PCR Purification Kit purified PCR product, and digested the purified product by using BamH Ⅰ | 第97页 |
| ·Preparing the Vector For Cloning | 第97-99页 |
| ·Digestion of Plasmid DNA using BamH Ⅰ | 第97-98页 |
| ·Dephosphorylation of linearized plasmid DNA ligation | 第98-99页 |
| ·Ligation | 第99页 |
| ·Preparation of competent cells | 第99-100页 |
| ·Transformation | 第100-101页 |
| ·The presence and orientation of the chitinase coding sequence | 第101页 |
| ·Direct Agrobacterium transformation: freeze-thaw method | 第101-102页 |
| ·Transformation and regeneration of tobacco plants | 第102-103页 |
| ·QIAGEN Protocol for isolation of DNA from plant tissue with the DNeasy plant mini Kit | 第103-105页 |
| ·Transgenic Plant DNA Analysis | 第105页 |
| ·Transgenic Plant Protein Gel Electrophoresis and Western Blot Analysis | 第105-111页 |
| ·Transgenic plant protein extraction | 第105-106页 |
| ·SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of proteins | 第106-109页 |
| ·Electro-blotting of protein | 第109-110页 |
| ·Immunoprobing of membrane(Western Blot) | 第110-111页 |
| ·Results | 第111-112页 |
| ·Cloning and transformation | 第111页 |
| ·Transgenic tobacco regeneration | 第111页 |
| ·Genomic and protein expression analysis | 第111-112页 |
| Section 2: Enzyme activity Assay and Confocal Laser Scanning Microscopy for Chitinase Gene Expressing Tobacco | 第112-118页 |
| ·Materials and Methods | 第113-115页 |
| ·Preparation of Samples for chitinase assay | 第113-114页 |
| ·Effect of pH on enzyme activity | 第114页 |
| ·Butyl-methyl methacrylate embedding of plant tissue for confocal laser scanning microscopy | 第114页 |
| ·Sectioning and staining | 第114-115页 |
| ·Results | 第115-118页 |
| ·Assay of chitinase activity | 第115-116页 |
| ·Effect of pH on the chitinase enzyme activity | 第116页 |
| ·The location of transformed chitinase gene in tissues scanned by confocal laser scanning microscopy | 第116-118页 |
| Section 3: The resistance evaluation of chitinase expressing tobacco lines to brown spot(Alternata alternaria)and anthracnose(Collectotrichumnicotianae) | 第118-124页 |
| ·Resistance evaluation of transgenic tobacco lines to anthracnose | 第118-120页 |
| ·Materials and Methods | 第118-120页 |
| ·Self-reproduction of transgenic plantlets(T_0) | 第118-119页 |
| ·Preparation of T_1、T_2、T_3 generations of transgenic lines for resistance evaluation | 第119页 |
| ·Preparation of inoculum | 第119页 |
| ·The method for inoculation | 第119-120页 |
| ·Resistance evaluation of transgenic tobacco lines to brown spot | 第120-121页 |
| ·Materials and Methods | 第120-121页 |
| ·Isolation of A.alternata | 第120页 |
| ·The preparation of inoculum | 第120页 |
| ·Method of inoculation | 第120-121页 |
| ·Results of resistance to anthracnose | 第121-122页 |
| ·The results of brown spot resistant evaluation | 第122-123页 |
| ·Discussion | 第123-124页 |
| Section 4: Analysis of the inheritance of chitinase expression and a study of gene flow via wind pollination | 第124-132页 |
| ·Materials and methods | 第126-127页 |
| ·Screening by using medium containing Kanamycin | 第126页 |
| ·T_2 generation western blot analysis | 第126-127页 |
| ·Study of gene flow in transgenic tobacco via wind pollination | 第127页 |
| ·Results | 第127-128页 |
| ·Screening by using medium containing Kanamycin | 第127页 |
| ·Western Blot Results | 第127页 |
| ·Study of gene flow in transgenic tobacco via wind pollination | 第127-128页 |
| ·Discussion | 第128-132页 |
| Section 5: A sensitive method for detecting chitinase gene expression in tobacco plants and cured tobacco leaves | 第132-138页 |
| ·Materials and Methods | 第133-136页 |
| ·Plant materials | 第133-134页 |
| ·T_2 generation western blot analysis | 第134页 |
| ·DNA extraction of chitinase expressing tobacco | 第134页 |
| ·PCR amplification | 第134-135页 |
| ·Semi-nested PCR amplification | 第135页 |
| ·Analysis of the amplified semi-nested PCR products | 第135-136页 |
| ·Results | 第136-137页 |
| ·Results of Western Blot analysis | 第136页 |
| ·PCR and semi-nested PCR results | 第136页 |
| ·Confirmatory tests | 第136-137页 |
| ·Discussion | 第137-138页 |
| Section 6: Bioassays for the impact of chitinase on insect and virus challenge | 第138-140页 |
| ·Materials and Methods | 第138页 |
| ·Bioassays for the impact of chitinase on inscct and virus challenge | 第138-140页 |
| 参考文献(References) | 第140-155页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文与著作 | 第155页 |
