| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 前言 | 第11-13页 |
| 1. 课题研究的背景及意义 | 第11页 |
| 2. 课题研究目的 | 第11-12页 |
| 3. 本论文主要研究内容 | 第12页 |
| 4. 本论文的创新点 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| ·纤维素酶概述 | 第13-14页 |
| ·纤维素酶酶系组成 | 第13页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第13-14页 |
| ·中性内切葡聚糖酶基因克隆表达研究的现状 | 第14-15页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的研究情况 | 第15-17页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第15-16页 |
| ·外源蛋白在酵母中优化表达 | 第16-17页 |
| ·优化外源蛋白的密码子 | 第16-17页 |
| ·提高整合拷贝数 | 第17页 |
| ·DNA 的化学合成法 | 第17-21页 |
| ·内切葡聚糖酶的应用研究进展 | 第21-23页 |
| ·纺织印染 | 第21页 |
| ·废纸脱墨 | 第21-23页 |
| 第二章 嗜热液化芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆 | 第23-36页 |
| ·材料与方法 | 第23-26页 |
| ·菌株及质粒 | 第23页 |
| ·药品与酶 | 第23页 |
| ·仪器设备 | 第23-24页 |
| ·引物设计 | 第24页 |
| ·培养基与主要试剂的配制 | 第24-26页 |
| ·实验方法 | 第26-30页 |
| ·嗜热液化芽孢杆菌基因组DNA 的提取 | 第26页 |
| ·内切葡聚糖酶基因的克隆 | 第26-27页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第27页 |
| ·目的片段的回收 | 第27-28页 |
| ·DNA 浓缩 | 第28页 |
| ·PCR 产物的TA 克隆 | 第28页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 | 第28-29页 |
| ·质粒小量提取 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的PCR 验证 | 第30页 |
| ·实验结果 | 第30-34页 |
| ·基因组DNA 提取 | 第30页 |
| ·全序列获得 | 第30-31页 |
| ·阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第31-32页 |
| ·核核苷酸序列及与同源性分析析 | 第32-34页 |
| ·小结 | 第34-36页 |
| 第三章 内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中表达 | 第36-48页 |
| ·实验材料 | 第36-37页 |
| ·菌株及质粒 | 第36页 |
| ·药品与酶 | 第36页 |
| ·培养基与主要试剂配制 | 第36-37页 |
| ·实验方法 | 第37-42页 |
| ·内切葡聚糖酶基因的PCR | 第37-38页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳及目的片段的割胶回收 | 第38页 |
| ·PCR 产物的双酶切 | 第38页 |
| ·表达载体 pET-20b 的双酶切 | 第38页 |
| ·表达质粒构建 | 第38-39页 |
| ·转化大肠杆菌克隆宿主菌株JM109 | 第39页 |
| ·阳性质粒的筛选 | 第39页 |
| ·转化大肠杆菌表达宿主菌 | 第39页 |
| ·蛋白质的诱导表达与检测 | 第39-40页 |
| ·大肠杆菌工程菌蛋白的SDS-PAGE 电泳 | 第40-41页 |
| ·内切葡聚糖酶活力测定 | 第41-42页 |
| ·结果 | 第42-47页 |
| ·内切葡聚糖酶全序列基因 CCel5AⅠ在在大肠杆菌中表达 | 第42-43页 |
| ·引物设计 | 第42页 |
| ·全序列 Cell5AⅠ的 PCCR 扩增 | 第42页 |
| ·CCel5AⅠ基因 DNA 片段和 pET-220b 表达载体的双酶切 | 第42-43页 |
| ·全序列 Cel5AⅠ与 pET-20b 表达载体的连接和阳性重组子的筛选 | 第43页 |
| ·内切葡聚糖酶全基因Cel5AⅠ的表达 | 第43页 |
| ·内切葡聚糖酶基因Cel5AⅡ在大肠杆菌中表达 | 第43-47页 |
| ·引物设计 | 第44页 |
| ·成熟肽基因 Cel5AⅡ的的 PCR 扩增 | 第44页 |
| ·成熟肽基因表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·内切葡聚糖酶成熟肽基因的表达 | 第45页 |
| ·SSDS-PAGEE 凝胶电泳 | 第45-47页 |
| ·小结与讨论 | 第47-48页 |
| 第四章 内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中分泌表达 | 第48-60页 |
| ·材料与方法 | 第48-51页 |
| ·菌株及质粒 | 第48页 |
| ·药品与酶 | 第48-49页 |
| ·引物设计 | 第49页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第49-51页 |
| ·实验方法 | 第51-55页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第51页 |
| ·PCR 扩增产物的割胶回收 | 第51页 |
| ·PCR 扩增产物的双酶切 | 第51页 |
| ·表达载体pPICZαB 的双酶切 | 第51-52页 |
| ·连接 | 第52页 |
| ·感受态细胞TOP10F’的制备与转化 | 第52页 |
| ·阳性质粒的筛选 | 第52页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第52-53页 |
| ·重组质粒的线性化(单酶切) | 第53-54页 |
| ·酵母菌株 GSll5 感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第54页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第54-55页 |
| ·重组子甲醇利用型的鉴定 | 第54-55页 |
| ·平板染色检测阳性转化子 | 第55页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第55页 |
| ·结果与分析 | 第55-58页 |
| ·内切葡聚糖酶基因Cel5AⅡ的PCR 扩增 | 第55页 |
| ·内切葡聚糖酶基因Cel5AⅡ的双酶切 | 第55页 |
| ·表达载体pPICZαB 的双酶切 | 第55-56页 |
| ·Cel5AⅡ与pPICZαB 表达载体的连接和阳性表达质粒的筛选 | 第56页 |
| ·质粒pPICZαB-Cel5AⅡ的大量提取及表达载体线性化 | 第56-57页 |
| ·酵母的电击转化 | 第57页 |
| ·酵母的电击转化 | 第57页 |
| ·重组酵母阳性筛选 | 第57-58页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第58页 |
| ·小结 | 第58-60页 |
| 第五章 人工合成内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中分泌表达 | 第60-79页 |
| ·实验材料 | 第60页 |
| ·菌株与质粒 | 第60页 |
| ·药品与酶 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-70页 |
| ·毕赤酵母偏爱密码子的分析和Cel5AⅡ基因的改造 | 第60-62页 |
| ·基因改造的依据 | 第60-61页 |
| ·CCel5A 基因的改造 | 第61-62页 |
| ·Cel5AⅢ人工合成的引物设计 | 第62-63页 |
| ·DA-PCR 和OE-PCR 法合成内切葡聚糖酶基因Cel5AⅢ | 第63-66页 |
| ·DA-PCR 操作步骤 | 第65-66页 |
| ·OE-PCR 操作步骤 | 第66页 |
| ·目的基因Cel5AⅢ加尾腺嘌呤 | 第66-67页 |
| ·TA 克隆及重组质粒转化大肠杆菌 | 第67页 |
| ·Cel5AⅢ基因全长定点突变纠错 | 第67-70页 |
| ·表达质粒pPICZαB-Cel5AⅢ的构建及线性化 | 第70页 |
| ·毕赤酵母的电击转化、重组毕赤酵母工程菌株的筛选及诱导表达 | 第70页 |
| ·结果与讨论 | 第70-77页 |
| ·内切葡聚糖酶基因Cel5AⅢ的改造 | 第70-73页 |
| ·内切葡聚糖酶基因Cel5AⅢ的 DA-PCCR 和 OEE-PCR 法法合成 | 第73页 |
| ·Cel5AⅢ基因全长定点突变纠错 | 第73-74页 |
| ·定点突变引物设计 | 第73-74页 |
| ·定点突变纠错 | 第74页 |
| ·表达质粒pPICZαB-Cel5AⅢ的构建 | 第74-75页 |
| ·重组质的的 pPICZZαB- Cel55AⅢ Vector 的大量提取及线性化 | 第75页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第75-76页 |
| ·重组表达菌株的筛选 | 第76页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第76-77页 |
| ·小结 | 第77-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-85页 |
| 详细摘要 | 第85-88页 |
