| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 引言 | 第11-26页 |
| ·研究背景及瘦素的发现 | 第11-12页 |
| ·瘦素的基因结构 | 第12-13页 |
| ·瘦素蛋白的结构及分布 | 第13-14页 |
| ·瘦素蛋白的结构 | 第13-14页 |
| ·瘦素的分布及影响因素 | 第14页 |
| ·瘦素受体 | 第14-15页 |
| ·瘦素的作用机制 | 第15-17页 |
| ·瘦素与下丘脑 | 第15-16页 |
| ·瘦素的信号传导机制 | 第16-17页 |
| ·瘦素生物学功能及相关疾病 | 第17-24页 |
| ·瘦素的生物学功能 | 第17-21页 |
| ·瘦素与相关疾病 | 第21-24页 |
| ·瘦素的应用前景 | 第24-26页 |
| ·肥胖的基因治疗 | 第24-25页 |
| ·重组瘦素蛋白治疗肥胖 | 第25页 |
| ·重组瘦素蛋白治疗糖尿病患者 | 第25-26页 |
| 第二章 重组表达载体 PET-28a(+)-His-mLeptin 的构建及在大肠杆菌中的诱导表达 | 第26-45页 |
| ·材料与方法 | 第27-37页 |
| ·菌种和质粒 | 第27-28页 |
| ·试剂及相关工具酶 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| ·培养基及实验相关溶液的配制 | 第28-30页 |
| ·His-mleptin 基因片段的获得 | 第30页 |
| ·His-mleptin 目的片段的回收纯化 | 第30-31页 |
| ·T 载体的构建及验证 | 第31页 |
| ·DH5α和 BL21 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第31-32页 |
| ·碱法抽提 His-mleptin-PMD19-TA 质粒 DNA 及 PET-28a(+)质粒 DNA | 第32-33页 |
| ·His-mleptin-PMD19-TA 质粒及 PET28a(+)质粒的 EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切 | 第33-34页 |
| ·目的基因片段与 PET-28a(+)质粒片段的连接 | 第34页 |
| ·BL21 感受态细胞的制备及连接产物的转化（详见 2.1.8） | 第34页 |
| ·重组质粒的 PCR 鉴定、酶切验证及序列测定 | 第34-35页 |
| ·工程菌株 BL21-pET28a-His-mleptin 的诱导表达 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析 | 第36页 |
| ·SDS-PAGE 考马斯亮蓝凝胶染色与脱色及 LC-ESI-MS/MS 鉴定 | 第36页 |
| ·工程菌株 BL21-pET28-His-mleptin 的保存 | 第36-37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-45页 |
| ·PCR 反应获得 His-mleptin 基因片段 | 第37页 |
| ·重组表达载体 pET28a-His-mLep 的构建 | 第37-38页 |
| ·重组表达载体的 pET28a-His-mLep 的鉴定 | 第38-39页 |
| ·工程菌株 BL21-pET28a-His-mleptin 的诱导表达及 LC-ESI-MS 鉴定结果 | 第39-43页 |
| ·讨论 | 第43-45页 |
| 第三章 大肠杆菌包涵体的变性、复性及目的蛋白的纯化、生物活性检测 | 第45-56页 |
| ·材料和方法 | 第46-50页 |
| ·材料与主要试剂 | 第46页 |
| ·主要仪器 | 第46页 |
| ·试验相关溶液的配制 | 第46-48页 |
| ·包涵体的提取和洗涤 | 第48页 |
| ·包涵体的变性与复性 | 第48页 |
| ·复性后纯化 | 第48-49页 |
| ·Ni-NTA-琼脂糖的再生 | 第49-50页 |
| ·纯化后的目的蛋白溶液 BCA 法测蛋白浓度 | 第50页 |
| ·纯化后目的蛋白 His-mleptin 的生物活性检测 | 第50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-55页 |
| ·包涵体的提取 | 第50-51页 |
| ·变性溶液缓慢复性结果 | 第51-52页 |
| ·复性后的 His-mleptin 溶液经 Ni-NTA 琼脂糖亲和层析 | 第52页 |
| ·BCA 蛋白浓度检测 | 第52-53页 |
| ·重组 mleptin 生物活性检测 | 第53-55页 |
| ·讨论 | 第55-56页 |
| 第四章 重组表达载体 pPICZα-His-mLeptin 的构建及在毕赤酵母中的表达 | 第56-68页 |
| ·材料与方法 | 第57-65页 |
| ·菌种和质粒 | 第57页 |
| ·试剂与相关工具酶 | 第57页 |
| ·主要仪器设备 | 第57-58页 |
| ·培养基及实验相关溶液的配制 | 第58页 |
| ·His-mleptin 基因片段的获得 | 第58-59页 |
| ·His-mleptin 目的片段的回收纯化 | 第59页 |
| ·纯化的 His-mleptin 与 T 载体的连接 | 第59页 |
| ·Top10 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第59-60页 |
| ·重组质粒 His-mleptin-PMD19-T 以及表达载体 pPICZα质粒的抽提 | 第60页 |
| ·His-mleptin-PMD19-T 质粒及 pPICZα质粒的 EcoRⅠ和 XbaⅠ酶切 | 第60-61页 |
| ·目的基因 His-mleptin 片段与 pPICZα质粒的连接 | 第61页 |
| ·重组质粒 pPICZα-His-mleptin 的转化和验证 | 第61-62页 |
| ·用于酵母转化 DNA 的制备 | 第62页 |
| ·毕赤酵母 GS115 的电转化 | 第62-63页 |
| ·毕赤酵母 GS115 重组转化子的验证 | 第63页 |
| ·重组毕赤酵母菌株的表达 | 第63-64页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析 | 第64-65页 |
| ·SDS-PAGE 考马斯亮蓝凝胶染色与脱色 | 第65页 |
| ·结果与讨论 | 第65-68页 |
| ·PCR 反应获得 His-mleptin 基因片段 | 第65页 |
| ·重组表达载体的 pPICZα-His-mLep 的鉴定 | 第65-66页 |
| ·工程菌的诱导表达结果 | 第66-67页 |
| ·讨论 | 第67-68页 |
| 第五章 不同碳源下毕赤酵母 GS115 蛋白组学分析 | 第68-82页 |
| ·材料与方法 | 第69-72页 |
| ·菌种 | 第69页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第69-70页 |
| ·各种溶液及培养基的配制 | 第70页 |
| ·GS115 上清蛋白和菌体蛋白样品的准备 | 第70-71页 |
| ·蛋白样品的 SDS-PAGE 及割胶 | 第71页 |
| ·进行 LC-ESI-MS/MS 分析前样品的处理 | 第71-72页 |
| ·归一化非标定量方法确定蛋白含量 | 第72页 |
| ·实验结果 | 第72-77页 |
| ·LC-ESI-MS/MS 分析结果 | 第72-77页 |
| ·讨论 | 第77-82页 |
| 第六章 总结及展望 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
