| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第12-14页 |
| 第一部分 前言 | 第14-25页 |
| ·糖研究综述 | 第14页 |
| ·GDP-Man的发现及其生物学意义 | 第14-16页 |
| ·GDP-Man代谢及其主要酶类 | 第16-19页 |
| ·pET系列原核表达系统简介 | 第19-23页 |
| ·本论文的研究目的和意义 | 第23-25页 |
| 第二部分 实验部分 | 第25-62页 |
| ·实验材料 | 第25-31页 |
| ·目的基因序列 | 第25-26页 |
| ·表达载体 | 第26页 |
| ·宿主 | 第26页 |
| ·试剂盒成品及各种酶试剂 | 第26页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用试剂 | 第26-27页 |
| ·PCR所用试剂 | 第27页 |
| ·制备感受态细胞所用试剂 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27-28页 |
| ·提取目的蛋白所需溶液及亲和层析所需介质 | 第28页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所需溶液 | 第28-29页 |
| ·酶活测定各种缓冲液的配制 | 第29页 |
| ·毛细管电泳条件 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29-31页 |
| ·实验方法与步骤 | 第31-40页 |
| ·目的基因cpsB的获得 | 第31-32页 |
| ·引物设计 | 第31页 |
| ·提取E.coli K12基因组 | 第31页 |
| ·PCR扩增基因cpsB | 第31-32页 |
| ·PCR反应体系 | 第31页 |
| ·PCR反应程序设定 | 第31-32页 |
| ·电泳检测PCR结果 | 第32页 |
| ·cpsB基因的溶液回收纯化 | 第32页 |
| ·pET-22b质粒载体的获得 | 第32-33页 |
| ·提取质粒pET-22b | 第32-33页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测 | 第33页 |
| ·cpsB-pET-22b质粒载体的构建 | 第33-34页 |
| ·cpsB基因双酶切反应 | 第33页 |
| ·回收纯化基因 | 第33页 |
| ·pET-22b质粒双酶切反应 | 第33页 |
| ·凝胶回收pET-22b质粒双酶切后的大片段 | 第33页 |
| ·pET-22b质粒片段和cpsB基因片段的连接反应 | 第33-34页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·转化E.coli DH5α | 第34页 |
| ·全细胞PCR检测 | 第34-35页 |
| ·反应体系 | 第34-35页 |
| ·PCR反应程序设定 | 第35页 |
| ·电泳检测PCR结果 | 第35页 |
| ·测序以验证插入基因序列 | 第35页 |
| ·重组蛋白Cps B的纯化与蛋白定量 | 第35-37页 |
| ·E.coli BL21(DE3)的培养及蛋白质的诱导表达 | 第35-36页 |
| ·提取E.coli BL21(DE3)表达的Cps B | 第36页 |
| ·Cps B的亲和层析纯化 | 第36页 |
| ·Cps B的SDS-PAGE电泳检测 | 第36页 |
| ·Cps B的脱盐与浓缩 | 第36页 |
| ·Cps B浓度测定 | 第36-37页 |
| ·酶动力学分析 | 第37-38页 |
| ·标准品的CE检测 | 第37页 |
| ·GDP-Man、GDP和GTP定量标准曲线 | 第37页 |
| ·不同底物的反应 | 第37-38页 |
| ·以GTP,Man-1-P为底物 | 第37-38页 |
| ·以GDP,Man-1-P,Na_2HPO_4为底物 | 第38页 |
| ·以GDP-Man,Na_4P_2O_7为底物 | 第38页 |
| ·以GDP-Man,Na_2HPO_4为底物 | 第38页 |
| ·反应体系的优化 | 第38-39页 |
| ·缓冲体系pH的优化 | 第38页 |
| ·金属离子种类的优化 | 第38-39页 |
| ·Mg~(2+)浓度的优化 | 第39页 |
| ·动力学参数的测定 | 第39-40页 |
| ·实验结果与分析 | 第40-62页 |
| ·目的基因cpsB的获得 | 第40页 |
| ·pET-22b质粒载体的获得 | 第40-41页 |
| ·重组E.coli DH5α全细胞PCR检测 | 第41页 |
| ·测序以验证插入基因序列 | 第41-43页 |
| ·Cps B的亲和层析纯化及SDS-PAGE电泳检测 | 第43页 |
| ·Cps B浓度测定 | 第43-45页 |
| ·蛋白浓度定量标准曲线的绘制 | 第43-44页 |
| ·Cps B浓度的计算 | 第44-45页 |
| ·酶动力学分析 | 第45-62页 |
| ·标准品的CE检测 | 第45页 |
| ·GDP-Man、GDP和GTP定量标准曲线 | 第45-48页 |
| ·GDP-Man定量标准曲线 | 第45-46页 |
| ·GDP定量标准曲线 | 第46-47页 |
| ·GTP定量标准曲线 | 第47-48页 |
| ·不同底物的反应 | 第48-53页 |
| ·以GTP,Man-1-P为底物 | 第48-51页 |
| ·以GDP,Man-1-P,Na_2HPO_4为底物 | 第51-52页 |
| ·以GDP-Man,Na_4P_2O_7为底物 | 第52页 |
| ·以GDP-Man,Na_2HPO_4为底物 | 第52-53页 |
| ·反应体系的优化 | 第53-57页 |
| ·缓冲体系pH的优化 | 第53-55页 |
| ·金属离子种类的优化 | 第55-56页 |
| ·Mg~(2+)浓度的优化 | 第56-57页 |
| ·动力学参数的测定 | 第57-62页 |
| 第三部分 结论与展望 | 第62-65页 |
| ·有关蛋白表达 | 第62页 |
| ·有关反应物质平衡 | 第62-63页 |
| ·有关酶动力学研究以及对其分类的讨论 | 第63-64页 |
| ·对于体外合成GDP-Man的讨论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第75-76页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第76页 |
